β-羟基丁酸在促进神经干细胞增殖中的用途

1.本发明属于药物研发技术领域，具体涉及β-羟基丁酸在促进神经干细胞增殖中的用途。


背景技术：

2.在人体发生神经退行性疾病或神经损伤后，损伤部位释放多种趋化性因子，静息状态的神经干细胞被重新激活并增殖、迁移至损伤部位，并进一步向神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。但成体中神经干细胞数量极为有限，如何在体内外提高神经干细增殖能力是神经系统损伤后修复和再生研究的难点。在体内神经干细胞增殖难度较大，而体外培养的nscs增殖能力有限。因此，如何有效促进nscs的增殖是目前急需解决的科研问题之一。β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate acid，β-ohb)，又称3-羟基丁酸，化学式：ch3ch(oh)ch2cooh，分子量约为104.1kd，cas号150-83-4。其结构式为如下所示：
[0003][0004]
β-ohb在体内主要是由脂肪酸代谢生成的乙酰乙酸经肝脏降解生成，并且血液中的β-ohb浓度受饮食结构和人体生理状态的影响。正常人体血液中β-ohb浓度小于0.7mmol/l，长期禁食后血浆中β-ohb甚至能达到6-8mm。β-ohb可抑制结肠癌的发生与生长；β-ohb能穿过血脑屏障，可代替葡萄糖作为大脑神经元的能量来源，维持神经元的完整性，并且通过降低活性氧生成、提高nad+/nadh比率来应对谷氨酸诱导的氧化应激反应进而保护神经元；β-羟基丁酸在临床上已用于镇静，实验室还将其作为组蛋白去乙酰化酶(hdac)的抑制剂使用。但是，β-ohb是否能够促进神经干细胞增殖目前尚未见报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供β-羟基丁酸在促进神经干细胞增殖中的用途。
[0006]
β-羟基丁酸在制备促进神经干细胞增殖的制剂中的用途。
[0007]
具体的，通过在培养基中添加β-羟基丁酸，促进体外分离的神经干细胞的自噬，同时促进神经干细胞的增殖。
[0008]
β-羟基丁酸在制备神经干细胞体内外增殖的药物中的用途。
[0009]
一种在体内外促进神经干细胞增殖的药用组合物，包括β-羟基丁酸和其药学上可接受的盐。
[0010]
优选的，还包括一种或多种药学上可接受的辅料或载体。
[0011]
所述辅料或载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0012]
所述药用组合物可制成的剂型为片剂、胶囊剂、泡腾片、颗粒剂、散剂、分散片、口服液、丸剂或注射剂。
[0013]
本发明的有益效果：本发明发现，β-羟基丁酸可以显著促进神经干细胞的增殖，同时，β-羟基丁酸增强了神经干细胞的自噬活性，β-羟基丁酸可能是通过提高自噬活性促进神经干细胞增殖。β-羟基丁酸可以用作添加剂制备促进神经干细胞增殖的药物和培养基中。该作用可用于体内外神经干细胞的增殖。
附图说明
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图1是采用western blot方法检测体外培养的神经干细胞在不同浓度的β-羟基丁酸处理后对神经干细胞增殖及自噬活性的影响。
[0015]
图2是在光镜下神经干细胞在不同浓度的β-羟基丁酸处理后神经球大小的变化。
具体实施方式
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为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
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实施例1β-羟基丁酸对神经干细胞体外扩增的作用
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1.β-羟基丁酸的处理
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β-羟基丁酸购自美国mce公司，产品目录号：hy-113378，cas号300-85-6，取100mgβ-羟基丁酸粉末，加入9.6061ml h2o，震荡使其充分溶解，混匀，此储液终浓度为100mm，分装后保存于-20℃。
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2.神经干细胞的提取与培养
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取孕13天的c57孕鼠，称重后按50mg/kg给予2％戊巴比妥钠麻醉。充分麻醉后浸泡于75％酒精中消毒，打开盆腔暴露子宫，小心取出胎鼠并置于预冷pbs的培养皿中，清洗残留血液后置于预冷d-hank’s液中，在解剖显微镜下分离胎鼠前脑和中脑，将分离出的脑组织剪成糜糊状并在冰上轻轻吹打，分离成单个细胞后用40μm滤网过筛，收集滤液后1200rpm离心5min。弃上清，加入完全培养基(dmem/f12+2％b27+1％n2+0.2μg/l表皮生长因子+0.2μg/l碱性成纤维细胞生长因子+1％glutamax)，对神经干细胞计数后，调整细胞密度为5
×
105个/ml接种到细胞培瓶中，置于37℃，5％co2培养箱中培养，收集培养3d左右神经球，800rpm离心5min后弃上清，使用accutase消化10min，加入dmem/f12培养基终止消化，再次离心、弃上清，加入新鲜完全培养基，并记为f1。
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3.神经干细胞的处理与实验分组
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取第三代神经干细胞并按如下组别进行干预：
[0024]
对照组：对照组为阴性对照，使用完全培养基；
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β-羟基丁酸干预组：在培养基中加入β-羟基丁酸并使终浓度为100μm和1mm。
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4.western blot实验
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按照常规方法收集并裂解神经干细胞，提取总蛋白：
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(1)β-羟基丁酸干预12h后2000rpm 5分钟收集神经细胞，弃上清。
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(2)加入适量ripalysis buffer(含蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂a、b、c，pmsf，dtt)。
[0030]
(3)冰上放置30分钟，使细胞充分裂解，每5分钟充分震荡一次。
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(4)12,000xg离心10分钟，转移上清液至新管中，与loading buffer充分混合，100℃水浴10分钟后进行下一步分析。
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(5)蛋白免疫印迹分析，检测增殖细胞核抗原pcna(proliferating cell nuclear antigen)、和自噬标记分子lc3(microtubule associated protein1 light chain3)的表达变化。
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5.光镜观察拍摄
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取培养瓶在光镜显微镜下观察、并对代表性神经球进行拍摄。
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实验结果：
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如图1所示，神经干细胞经过β-羟基丁酸处理后，与空白对照组相比，β-羟基丁酸显著促进了pcna和lc3ii的表达，表明β-羟基丁酸增加了神经干细胞增殖能力和自噬活性，并且具有浓度依赖性。与此同时，光镜下也可观察到在1mm的β-羟基丁酸作用下神经球更为饱满，神经球体积更大，表明神经干细胞数量更多(图2)。以上结果说明，β-羟基丁酸促进了神经干细胞的增殖，并且有可能通过影响自噬活性来实现对增殖的调控。
[0037]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。