用于灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的多价适体细胞传感器及其制备方法和应用

本发明涉及生物，具体涉及一种用于灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的多价适体细胞传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤细胞通过上皮-间质转化(emt)获得高的迁移和侵袭能力，诱导循环肿瘤细胞(ctcs)的生成和存活。鉴于emt是诱导ctcs促进肿瘤转移的关键因素，ctcs作为肿瘤治疗的预后标志物和靶点的作用受到越来越多的关注。最近的研究表明，emt后的ctcs，包括进化的上皮-间质ctcs(e-m ctcs)和间质ctcs(m-ctcs)，具有更多的临床意义，与肿瘤转移、疾病进展和不良预后有关。因此，建立一种能够同时捕获ctcs间充质特征和上皮表型的策略，将为更深入地研究emt-ctcs收集的临床特点提供机会。

2、目前可用的ctcs检测方法大多针对肿瘤细胞表面表达的上皮细胞标志物，如上皮细胞黏附分子(epcam)。在这些方法中，用epcam抗体捕获ctcs，然后测定细胞角蛋白(cks)的表达，将其作为主要诊断依据。在这种情况下，epcam和cks是上皮特异性标志物。然而，外周血中也可能存在一些非肿瘤性上皮细胞，而其他ctcs可能由于emt过程中上皮抗原丢失而无法被检测到，从而导致假阳性或假阴性的检测结果。当ctcs计数用于评估肿瘤对治疗的反应、肿瘤复发风险以及肿瘤筛查时，这样的误差会对临床决策产生很大的影响。emt过程通常伴随间充质标志物(如vimentin、n-cadherin和twist)的过表达和上皮标志物(如epcam、ck、e-cadherin等)的表达降低。对不同类型癌症的分析表明，细胞表面波形蛋白(csv)蛋白是上皮-间质转化后的循环肿瘤细胞的通用标志物，可作为epcam的补充标志物。尽管抗csv抗体已应用于多个分析平台的构建，但由于存在识别效率低、修饰复杂、释放效率低等瓶颈，限制了其在临床上的广泛应用，进一步阻碍了上皮-间质转化后的循环肿瘤细胞转移机制的研究。此外，现有可用的基于亲和力的ctc检测方法通常依赖于靶向上皮标记物，但这些标记物不能有效捕获emt过程中的ctc，缺乏一种灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的方法。

3、由于上述的基于抗csv抗体检测ctcs的方式的固有缺点，因此我们希望发明一种新的基于核酸适配体的ctcs检测方式，从而实现更加精准、高效的检测。与抗体相比，作为核酸识别分子的适体更适合用于ctcs的分析，因为它们具有几个优点，包括体积小、修饰简单、批次间差异小、有效释放且不影响细胞活性。迄今为止，已经开发了多种基于适体的方法用于癌细胞检测，包括流式细胞术、荧光分析和电化学传感器。其中，电化学传感器具有成本低、操作简单、反馈快、灵敏度高等优点。因此，结合epcam和csv适配体构建电化学传感器可用于全面、灵敏地捕获异种来源的ctcs。然而，附着在电极上的单链dna适配体通常会缠绕和聚集，阻碍其与细胞的有效结合。为了克服这一挑战，我们考虑利用dna自组装机制构建基于多价适配体纳米支架(mas-细胞传感器)的电化学细胞传感器，用于emt-ctcs的捕获、检测和释放。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明目的在于提供一种用于灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的多价适体细胞传感器。

2、为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种多价适配体纳米支架，所述的适配体纳米支架通过核酸适配体链由epcam适配体链apt1和csv适配体链apt2发生dna自组装形成，epcam适配体链apt1的序列为seq id no:1所示的核苷酸序列，csv适配体链apt2的序列为seq id no:2所示的核苷酸序列。

3、本发明的一种用于灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的多价适体细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)预处理金电极，提高其促电子转移能力，增加其表面活性点密度，从而提高其电催化性能,达到活化的目的；

5、(2)将设计的epcam适配体链apt1和设计的csv适配体链apt2进行杂交链式反应，然后通过dna自组装形成的巯基化多价适配体支架通过金-硫醇键连接到预处理完毕的金电极ge表面，制成工作电极。

6、进一步地，在步骤(1)中，将裸金电极ge浸入水虎鱼溶液中30分钟以去除吸附的有机物，然后分别用粒径为1μm和0.3μm的氧化铝粉末抛光；随后，电极在无水乙醇中超声处理，然后用蒸馏水处理5分钟，然后在50％h2no3中浸泡30分钟。电极在0.5m h2so4中通过循环电位进行电化学活化，直至达到稳定的循环伏安cv，然后用高纯度氮气吹干备用；

7、在步骤(2)中，将tcep还原的1μm的sh-apt1和1μm的sh-apt2滴加到电极上，分别孵育2h；将电极用1mm mch溶液封闭30min，用pbs洗涤两次，形成单适配体工作电极备用。

8、进一步地，在步骤(1)中，水虎鱼溶液中，浓h2so4与30％h2o2的体积比为3:1。

9、本发明所述的制备方法制得的用于灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的多价适体细胞传感器。

10、本发明所述的用于灵敏检测上皮-间质转化期间循环肿瘤细胞的多价适体细胞传感器在肿瘤细胞检测方面的应用。

11、进一步地，所述的肿瘤细胞为胶质瘤ctcs、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞或卵巢癌细胞。

12、有益效果：本发明mas-细胞传感器具有高灵敏度，由于其基于emt过程不同阶段ctcs表面epcam和csv的表达特征进行识别，因此对靶细胞的识别不受emt阶段的影响。电极吸附ctcs后，传感器表面[fe(cn)6]3-/4-的ret大幅增加，证明了对胶质瘤ctcs的灵敏检测。

13、与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明的纳米支架的刚性结构提高了表面适配体探针的密度和取向，两种适配体的有序排列提高了ctcs在emt各阶段的识别效率，dna纳米支架的生物友好性可以保护细胞免受损伤。

14、(2)本发明构建的基于多价适配体纳米支架的电化学细胞传感器(mas-细胞传感器)，用于检测和分析emt-ctc，包括上皮-ctcs、上皮-间质ctcs和间质ctcs。具体来说，随着emt的发生，上皮细胞黏附分子(epcam)的表达水平降低，而细胞表面波形蛋白(csv)的水平显著增加，因此可以对处于不同emt阶段的ctcs进行识别，对靶细胞的识别不受emt阶段的影响，无论ctcs处于emt的哪个阶段，该细胞传感器都可为其提供了可靠的检测方案。

15、(3)本发明的纳米支架可以有效地将emt各个阶段的ctcs吸附到电极表面从而获得高度放大的电化学信号，实现了低至6个细胞/ml的ctcs检测，因此改善了仅依赖epcam表达检测胶质瘤ctc的传统方法灵敏度低的问题。

16、(4)除了在胶质瘤细胞中鉴定出的上述优点外，该传感器可应用于多种类型ctcs的检测，如乳腺癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌细胞。这些肿瘤的ctcs在emt过程中表现出与胶质瘤相同的epcam和csv表达的总趋势。本发明提出的mas-细胞传感器将激发其它智能设备的设计，将为癌症的早期诊断和高级临床分析提供光明的前景。