一种帕罗西汀半抗原和人工抗原及其制备方法与应用与流程

本发明涉及帕罗西汀检测领域，尤其涉及一种帕罗西汀半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、帕罗西汀(paroxetine)为5-ht再摄取抑制剂类抗抑郁药(ssris)，能选择性抑制5-羟色胺(5-ht)的再摄取，提高神经突触间隙内5-ht的浓度，从而产生抗抑郁作用。它只微弱地抑制去甲肾上腺素与多巴胺的再摄取。本药不与肾上腺素α1、α2或β受体发生作用，也不与多巴胺d2或组胺h1受体结合，不抑制单胺氧化酶。本药可广泛分布于各种组织和器官，仅1％出现在体循环中。蛋白结合率高达95％。药物经肝脏p450同工酶代谢。帕罗西汀大部分经肾随尿排出；约36％由粪便排出；也可经乳汁排泄。帕罗西汀是ssri类里面最强再摄取剂，但是它也是唯一一个具有轻微抗胆碱作用的药物。

2、为药物滥用需要，医务人员可通过检测尿液中的帕罗西汀，以帮助诊断帕罗西汀依赖性和帕罗西汀的康复性。目前，常用到高效液相色谱法(hplc)、液质联用技术(lc-ms)方法等对帕罗西汀有关物质检测。该方法分离分析能力强，灵敏度高，结果可靠、精确，但结构复杂，对环境的温度、湿度要求高，维护成本高。质谱仪是高精密仪器，需要经过专门培训的技术员才可以操纵，且测试速度慢，因此不利于对药物滥用检测的广泛推广。因此，需要开发一种简便高效的帕罗西汀物质检测方法。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是为了克服现有技术下使用hplc、lc-ms检测帕罗西汀对仪器及操作人员要求高，不易推广，其检测速度慢的问题，提供一种帕罗西汀人工半抗原，可特异性识别帕罗西汀。

2、一种帕罗西汀半抗原，其分子结构式如式(ⅰ)所示，

3、

4、2-羟基帕罗西汀分子中没有活性基团可以连接载体蛋白，因此对其进行修饰，连上合适的间隔臂使其产生羧基或者氨基，以便于偶连载体蛋白。

5、本发明的第二个目的是提供一种帕罗西汀人工半抗原的制备方法，采用如下技术方案：

6、步骤(1)、将2-羟基帕罗西汀溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，再加入三乙胺和二碳酸二叔丁酯，45-50℃下加热回流，反应完全后将反应液冷却至常温，减压蒸干溶剂，得到油状物a；

7、步骤(2)、将油相物质a溶于吡啶中，然后加入戊二酸酐和4-二甲氨基吡啶(dmap)，98-100℃下加热回流，反应完全后将反应液冷却至常温，减压蒸干溶剂，得到油状残渣；将油状残渣加入二氯甲烷，分别用纯化水和饱和nacl洗涤，收集二氯甲烷相，干燥，过滤，减压蒸干得油状物b；

8、步骤(3)、将油状物b溶于hcl与1，4-二氧六环的混合溶液中，98-100℃下加热搅拌回流，减压蒸干溶剂得油状物c；

9、步骤(4)、将油状物c溶于苯，置于冰水浴中，加入三氟乙酸酐，常温搅拌一段时间后置于78-81℃下加热搅拌回流，反应完全后将反应液转干分离得油状物d，即帕罗西汀人工半抗原。

10、作为优选，步骤(1)中，2-羟基帕罗西汀与三乙胺和二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1：2：2；

11、作为优选，步骤(1)中，反应温度为45℃，反应时间为14.5-16h，更为优选为15h；

12、作为优选，步骤(2)中，油状物a、戊二酸酐和4-二甲氨基吡啶(dmap)的摩尔比为(10-12)：(4-5.5)：(1-2)，更为优选为10：5：1；

13、作为优选，步骤(2)中，反应温度为100℃，反应时间为16-19h，更为优选为18h；

14、作为优选，步骤(3)中，每ml混合溶液中加入7.5nmol油状物b；

15、作为优选，步骤(3)中，加热温度为100℃，搅拌回流反应的时间为5-6.5h，更为优选为6h；

16、作为优选，步骤(3)中，混合溶液中hcl的浓度为2mol/l；

17、作为优选，步骤(4)中，每ml苯中加入0.056mmol油状物c；

18、作为优选，步骤(4)中，搅拌时间为0.8-1.2h，更为优选为1h；

19、作为优选，步骤(4)中，油状物c与三氟乙酸酐的摩尔比为(1-1.3)：(1.8-2.4)，更为优选为1：2；

20、作为优选，步骤(4)中，加热温度为80℃，搅拌回流反应的时间2.6-3.0h，更为优选为3h。

21、在帕罗西汀半抗原的合成反应中可以使用薄层色谱法监测棕色油状物的生成情况以判断反应是否完全，使用的层析液中各组分的体积比为95％乙醇：二氯甲烷：1，4-二氧六环：氨水＝8：10：1：1，产物rf＝0.4-0.5。

22、本发明的第三个目的是提供一种帕罗西汀人工抗原，由式(ⅰ)半抗原与载体蛋白偶联得到；其拥有帕罗西汀的分子结构特征，可被动物免疫活性细胞所识别，产生可特异性结合帕罗西汀的抗体。其分子结构式如式(ⅱ)所示：

23、

24、其中r表示载体蛋白；

25、作为优选，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白和鸡卵清白蛋白中的一种。

26、本发明的第四个目的是提供一种帕罗西汀人工抗原的制备方法，采用如下技术方案：

27、步骤(1)、将帕罗西汀人工半抗原溶于n,n-二甲基甲酰胺dmf中，再加n-羟基琥珀酰亚胺nhs和环己基碳酰二亚胺，常温搅拌反应15-18小时，离心取上清液，得到a液；

28、步骤(2)、将载体蛋白溶于pbs缓冲液中作为b液，b液中载体蛋白浓度为4-9mg/ml；

29、步骤(3)、搅拌条件下将a液滴加到b液中，在低温下静置过夜，得到人工抗原混合液；

30、步骤(4)、将步骤(3)所得人工抗原混合液在碱性透析液中透析多次，再转入pbs缓冲液中透析多次，透析结束后离心取上清液，即得到帕罗西汀人工抗原。

31、作为优选，步骤(1)中，所述帕罗西汀人工半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺的摩尔比为(1.3～1.4)：1.9：1.9；

32、作为优选，步骤(2)中，b液中载体蛋白浓度为5mg/ml；

33、作为优选，步骤(3)中，所述a液与b液体积比为1:5；

34、作为优选，步骤(3)中，低温为4℃；

35、作为优选，步骤(4)中，碱性透析液为碳酸钠溶液，其ph＝11.05-12.05；pbs缓冲液浓度为0.1mol/l，ph为7.2-7.4；

36、作为优选，步骤(4)中，碱性透析液中透析2-3次，每次透析时间为24h；

37、作为优选，步骤(4)中，pbs缓冲液中透析6-7次，每次透析时间大于2h。

38、帕罗西汀半抗原与n-羟基琥珀酰亚胺、n,n-环己基碳二酰亚胺反应得到活性酯，该活性酯与载体蛋白偶联得到帕罗西汀人工抗原，此反应过程保护了帕罗西汀的活性位点，增加该抗原的免疫原性和反应原性，进行动物免疫时易获得相应的抗体，为后续检测试剂的制备提供保证。可通过紫外扫描透析结束后离心得到的上清液鉴定半抗原与bsa是否偶联成功。

39、本发明的第五个目的是提供一种帕罗西汀多克隆抗体，由式(ⅱ)人工抗原经动物免疫得到。

40、所述帕罗西汀多克隆抗体的制备步骤包括：将帕罗西汀人工抗原经pbs缓冲液稀释至1.67mg/ml，与弗式佐剂按体积比1:1乳化，然后在兔子背部进行多点皮下注射，每次注射量在500ug，7天后少量取血进行效价检测，确认免疫是否成功，免疫成功后采集血清纯化制得帕罗西汀多克隆抗体。

41、本发明的第六个目的是提供一种帕罗西汀胶体金检测试纸，包括检测线、质控线、结合垫，所述检测线采用帕罗西汀人工抗原为原料点膜获得；

42、作为优选，所述质控线用羊抗鼠igg或羊抗兔igg为原料点膜获得，所述结合垫使用帕罗西汀多克隆抗体-胶体金复合物喷洒在结合垫上获得。

43、本发明的帕罗西汀胶体金检测试纸检测灵敏度高，可检出的浓度达500ng/ml，因本发明的帕罗西汀检测试剂条检测原理使用了竞争法，所以检测线的显色强度与样本中帕罗西汀的浓度呈负相关。同时运用了胶体金标记，可进行定性检测。使用者肉眼观察胶体金在nc膜上的聚集显色情况，在质控线出现的情况下，t线出现则为阴性，t线不出现则为阳性。

44、作为优选，所述质控线和检测线经以下过程制成：使用1.0mg/ml的羊抗兔igg与0.1mg/ml的羊抗鼠igg，以1.0μl/cm的喷量喷点在硝酸纤维素膜上作为质控线，使用0.3mg/ml的帕罗西汀抗原，以1.0μl/cm的喷量喷点在硝酸纤维素膜上作为检测线。

45、作为优选，所述帕罗西汀多克隆抗体-胶体金复合物的制备步骤包括：调节胶体金溶液ph值为7.6，加入帕罗西汀多克隆抗体溶液，搅拌后加入1％peg2000缓冲液，100000g 4℃离心60min，去沉淀用含peg2000缓冲液重悬，重复2～3次得到胶体金标记蛋白，然后凝胶过滤法对胶体金标记蛋白进行纯化，以含有bsa、叠氮化钠的pbs缓冲液洗脱，收集得到帕罗西汀多克隆抗体-胶体金复合物。

46、作为优选，所述结合垫的制备步骤包括：将帕罗西汀多克隆抗体-胶体金复合物稀释在含牛血清白蛋白的pbs缓冲液中至复合物初始od值的1/4～1/3，以1.0μl/cm的喷量均匀喷洒在结合垫上。

47、作为优选，所述结合垫制备时还包括向含牛血清白蛋白的pbs缓冲液中加入50mg/ml海藻糖和200mg/ml蔗糖。

48、通过添加蔗糖和海藻糖有效保持帕罗西汀多克隆抗体-胶体金复合物的活性，延长结合垫的有效期，提高产品性能。

49、本发明具有如下有益效果：

50、(1)以2-羟基帕罗西汀为前体合成帕罗西汀半抗原和帕罗西汀人工抗原，得到的抗原的免疫原性和反应原性好，进行动物免疫时易获得相应的抗体，并且可用于制备帕罗西汀胶体金-检测试纸；

51、(2)本发明提供的帕罗西汀胶体金-检测试纸，灵敏度高，胶体金检出限为500ng/ml，检测线的显色强度和帕罗西汀的浓度呈现负相关性，可快速检测尿液、血液、唾液中帕罗西汀，可以通过肉眼定性检测，相比于液相色谱-串联质谱法更加方便快捷，对仪器要求低，操作简便，利于对药物滥用检测的广泛推广。