多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体指一种多聚体在car表达细胞检测和细胞制备中的应用。

背景技术：

1、car-t(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy)是嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的非常具有前景的肿瘤免疫治疗方法。

2、t细胞也叫t淋巴细胞，技术人员通过基因工程技术，将t细胞激活，将car(肿瘤嵌合抗原受体)转导入t淋巴细胞，获得car-t细胞，它利用其car的特性，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。

3、随着car-t疗法的发展，需要特异性高、敏感性好、精确度佳和多功能的car染色试剂来进行生化分析、进行临床前研究、分析患者生物样本以及开发新的car。然而，现有的car染色试剂均存在局限性。结合car单链抗体的通用car染色试剂(多克隆抗igg抗体和蛋白l)受到非特异性结合、与其他抗体不相容的限制，以及对多步骤染色程序的要求。虽然某些特定的car染色试剂(目标抗原和抗独特型抗体)可以在市场上买到，但通常受到蛋白质稳定性和高开发成本的限制。此外，所有现有的car染色试剂因结合价≤2而应用受限。因此开发具有更高亲和力的，更优检测性能的car染色试剂，具有重要的应用前景。

4、现有中国专利公开了“一种多聚体结合试剂”(公开号cn107847544a)，有望解决上述问题，填补这一领域的应用空缺。

5、此外，现有技术路线在制备car-t细胞时，常采用抗cd3/cd28抗体偶联磁珠刺激从病人外周血提取的t细胞后，加入慢病毒对t细胞转染以表达抗cd19的car，再继续利用抗cd3/cd28抗体偶联磁珠来刺激扩增生产car-t细胞。除了磁珠毒性的问题，该方法存还在非特异性细胞增殖的缺陷。这是由于car-t细胞慢病毒转染效率较低，仅有部分t细胞在转染后表达car分子，而抗cd3/cd28抗体偶联磁珠会刺激所有t细胞，无差别地扩增表达和不表达car的细胞群体，导致目前生产的car-t细胞产品纯度比较低。现有正常情况下，仅有少部份(～30％)获得的细胞是car-t细胞，而大部分细胞(～70％)是非car-t细胞，如图11b所示。此技术缺点极大地影响和限制了car-t细胞的临床治疗效果，是目前car-t细胞生产的一大主要亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述car-t应用技术中存在的问题，提供一种多聚体在car表达细胞制备和检测中的应用。这里car表达细胞可以是car-t细胞、car-nk细胞、car巨噬细胞或其他car转导细胞。

2、本发明首先提供了一种car染色试剂，它包含多聚体-抗原分子的结合物，所述抗原分子是生物素标记的对待检测的car具有特异性结合力的抗原分子；

3、所述多聚体包含：

4、1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的c端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自seq id no:1或seq id no:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如seq idno:3；

5、2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原分子；所述链霉亲和素上有可检测的标记物。

6、需要说明的是，上述car染色试剂中所述多聚体及其蛋白亚基的序列中的seq idno:1与中国专利“一种多聚体结合试剂”(公开号cn107847544a)中公开的一致。即本技术揭示了其可以作为car染色试剂的用途。

7、优选地，所述待检测的car具有低亲和力特性。

8、优选地，所述待检测的car的kd值≥0.1nm。

9、可选地，所述待检测的car为cd19的car。

10、可选地，所述待检测的car由针对同一种抗原分子的多种car的混合组成。

11、优选地，所述car染色试剂的工作温度为0～25℃，更有选为4℃。

12、其次，本发明提供了一种car表达细胞特异扩增生产试剂，包含抗原与多聚体的结合物；

13、所述抗原为表达在靶细胞上的被car分子特异性识别的抗原分子；

14、所述多聚体包含：

15、1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的c端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列如seq id no:1；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如seq id no:2；

16、2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。

17、需要说明的是，上述多聚体应理解为包含五聚体、八聚体、十二聚体、甚至二十聚体等多个由数量不等的支架蛋白和链霉亲和素的结合物，一个支架蛋白可以结合不同数量的链霉亲和素，而四个链霉亲和素又可以结合1个以上的支架蛋白，由此排列组合可以得到不同形式的多聚体。本技术不仅公开了十二聚体可以作为生产试剂进行car表达细胞特异性扩增的用途，还揭示了其他多聚体同样能有此用途，仅存在效果优劣的差异。

18、优选地，所述试剂的使用温度为30～40℃，优选37℃。

19、可选地，所述多聚体为十二聚体。

20、另一种本发明提供的car表达细胞特异扩增生产试剂，包括一个链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被car分子特异性识别的抗原分子，将该car表达细胞特异扩增生产试剂命名为抗原链霉四聚体。其使用温度同样为30～40℃，优选37℃。

21、本发明还提供了上述car表达细胞特异扩增生产试剂在car-t细胞制备过程中的应用。

22、具体还提供了一种car-t细胞特异扩增培养方法，包括如下步骤：将前述的car表达细胞特异扩增生产试剂加入到在培养的car-t细胞群体中，使培养所生产的car-t细胞达到预设的治疗标准。一般来说，上述试剂应该伴随car-t细胞的生长过程，以持续刺激特定car-t细胞增殖。

23、再次，本发明提供了一种car表达检测试剂，包含用寡核苷酸标记的抗原多聚体，所述抗原多聚体为抗原与多聚体的结合物；

24、所述抗原为表达在靶细胞上的被car分子特异性识别的抗原分子；

25、所述多聚体包含：

26、1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的c端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自seq id no:1或seq id no:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如seq idno:3；

27、2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。

28、优选地，所述多聚体为十二聚体。

29、另一种本发明提供的car表达检测试剂，包含未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被car分子特异性识别的抗原分子，将该car表达检测试剂命名为抗原链霉四聚体。

30、本发明还提供了一种car表达检测方法，包括步骤：利用上述car表达检测试剂染色car，再通过单细胞测序进行car表达检测。

31、此外，本发明还提供了一种定点生物素标记分子，是位于抗原蛋白的序列中，使所述抗原蛋白可被生物素化的标记分子，其氨基酸序列如seq id no.7所示。

32、一种cd19的car抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，所述抗原为具有可生物素化的位点的cd19抗原蛋白，其氨基酸序列如seq id no.4所示；所述cd19抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；

33、所述多聚体包含：

34、1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的c端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自seq id no:1或seq id no:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如seq idno:3；

35、2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。

36、一种her2的car抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，所述抗原为具有可生物素化的位点的her2抗原蛋白，其氨基酸序列如seq id no.5所示；所述her2抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；

37、所述多聚体包含：

38、1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的c端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自seq id no:1或seq id no:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如seq idno:3；

39、2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。

40、一种tn糖苷的car抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，所述抗原为具有可生物素化的位点的tn糖苷抗原蛋白，其氨基酸序列如seq id no.6所示；所述tn糖苷抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；

41、所述多聚体包含：

42、1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的c端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自seq id no:1或seq id no:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如seq idno:3；

43、2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。

44、最后，本发明还揭示了上述cd19的car抗原多聚体、her2的car抗原多聚体及tn糖苷的car抗原多聚体试剂在car染色、car表达细胞特异扩增生产，car表达检测中的应用。

45、以及本发明还揭示了多聚体和四聚体在制备car染色试剂、car表达细胞特异扩增生产试剂、car表达检测试剂中的应用，其中多聚体和四聚体上的链霉亲和素用于结合已生物素标记的对目标car具有特异性结合力的抗原。

46、为了产生用于car-t细胞检测的高亲和力car染色试剂，我们设计、构建并验证了两种形式的抗原多聚体：抗原链霉四聚体和抗原十二聚体。抗原多聚体由在链霉亲和素支架上多聚的car抗原组成(图1a)。

47、在所有实验中，抗原分子都是位置特异性生物素化而不是随机生物素化，以减少car结合位点的高阶齐聚和空间位阻。我们在三种不同的第二代car上验证了抗原多聚体的有效性：抗cd19 car(克隆fmc63，“construction and pre-clinical evaluation of ananti-cd19 chimeric antigen receptor”,j immunother.2009september；32(7):689–702.doi:10.1097/cji.0b013e3181ac6138.)、抗her2 car(克隆c6ml3-9,“t cellactivation by antibody-like immunoreceptors:increase in affinity of thesingle-chain fragment domain above threshold does not increase t cellactivation against antigen-positive target cells but decreases selectivity”,jimmunol 2004；173:7647-7653.doi:10.4049/jimmunol.173.12.7647)和抗tn car(克隆237,“multiple cancer-specific antigens are targeted by a chimeric antigenreceptor on a single cancer cell”,jci insight.2019；4(21):e130416.https://doi.org/10.1172/jci.insight.130416.)(图1b)。

48、每个用于验证的car，从n端到c端由细胞外单链抗体、cd8α铰链和跨膜区、4-1bb和cd3δ细胞内结构域以及单体增强型绿色荧光蛋白(megfp)组成。c端的megfp用来示踪car转导效率和表达。铰链、跨膜区和细胞内区域的设计与tisagenlecleucel中使用的临床car结构相同。其中抗cd19和抗her2 car采用的是人源结构域，而抗tn car采用的是小鼠结构域。三个用来验证的car可以有效测试抗原多聚体的效用：(1)抗cd19 car使用的是与临床cd19car-t疗法相同的基于fmc63的单链抗体片段；(2)car结合亲和力kd值范围从0.3nm到140nm，代表不同亲和力的car；(3)抗原分子大小在2.6kda到73kda之间。

49、本发明的有益效果：

50、根据细胞系和患者生物样本的测试结果，抗原多聚体能够实现高度特异、灵敏和精确的car检测，可通过磁性富集用于敏感检测罕有的car-t细胞，还可以利用温度控制和特异的car-t细胞刺激用于激活表型和特异扩增，以及通过单细胞多组学分析实现多维car-t细胞分析。通过切换不同的抗原，抗原多聚体可以很容易地扩展应用到现有的和新发现的car。我们在三个独立的car(抗cd19、抗her2和抗tn)上展示了这种扩展性。虽然我们在目前的研究中只测试了抗原链霉四聚体和抗原十二聚体，但抗原多聚体也可以扩展到其他价态，如二聚体、五聚体、八聚体和右旋体。由于其多功能和可扩展性，抗原多聚体是一类新的抗原car染色试剂，适用于car-t细胞、car-nk细胞、car巨噬细胞或其他car转导细胞，具有广泛的car表达细胞研究和临床应用前景。此外，利用抗原多聚体来特异性生产car-t细胞的方法，不同于目前的用非特异性的抗cd28/cd3磁珠来非特异激活扩增t细胞的方法，由于抗原-多聚体只特异性地激活扩增相应的car-t细胞，不会激活其他t细胞，也不需要担心磁珠潜在的毒性，是一种更优的car-t细胞制备方法。此外，本发明还用寡核苷酸标记了抗原多聚体，实现以单细胞测序进行car表达检测。