检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学，具体而言，涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。

背景技术：

1、子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。近年来，子宫内膜癌的发病率在全球范围内呈现逐年上升的趋势，且患者年龄愈来愈年轻化。据统计，在2018年，全球有超过38万的子宫内膜癌新发病例，有89929例的死亡病例。子宫内膜癌发病率的增加部分归因于与其发生和发展相关的危险因素的流行率的上升，如肥胖、糖尿病、高血压等。

2、子宫内膜癌通常分为2种类型，即ⅰ型和ⅱ型。ⅰ型是最常见的形式，ⅰ型癌症患者在所有子宫内膜癌患者中的比例约为70％，ⅰ型子宫内膜癌的发生与无孕激素拮抗的雌激素持续刺激相关，ⅰ型癌症也被称为子宫内膜腺癌，且这种类型的癌症通常是低级别的。ⅱ型癌症通常是高级别的，主要包括乳头状浆液性癌和透明细胞癌，ⅱ型癌症预后较差，复发和转移的风险较高。ⅱ型子宫内膜癌患者在所有子宫内膜癌患者中的比例约10％，但是ⅱ型癌症与40％的子宫内膜癌死亡病例相关。子宫内膜增生是子宫内膜癌的前体病变，1％～3％的子宫内膜增生患者有癌变的风险，这其中非典型性增生患者比单纯增生或复杂性增生患者具有更高的癌变风险，约有30％～40％的非典型性子宫内膜增生患者伴随有子宫内膜腺癌。

3、通常情况下，子宫内膜癌的患者在确诊前会出现非正常的阴道出血症状，这为癌症的早期诊断和治愈性治疗提供的宝贵的机会。但是，很多妇科疾病，如阴道炎、盆腔炎、子宫内膜息肉、子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫内膜萎缩等也会导致非正常的阴道出血，因此，在确诊前的诊断过程中，这些患者需要接受较多的检查并承受巨大的心理压力。常用的诊断子宫内膜癌的方法为阴道超声法，但是在患者发生子宫腺肌症、多发性子宫肌瘤、子宫内膜息肉或既往的子宫手术的条件下，阴道超声诊断的性能会大打折扣，即常规的影像学方法难以区分子宫良性疾病和子宫内膜癌。此时，通常会对患者进行子宫内膜活检以判断其是否为子宫内膜癌患者，但是子宫内膜活检受取样的限制较大，且为有创操作。

4、因此，有必要开发一种分子诊断试剂，能够有效区分子宫内膜癌患者或子宫良性病变患者，从而妥善诊断非正常阴道出血的患者，以减轻患者的心理压力，避免对良性疾病患者进行过度诊疗。

5、有鉴于此，特提出本技术。

技术实现思路

1、本技术实施例的目的之一包括将检测目标区域(chr6:27679636-27680274、chr6:10390489-10390886或者它们的部分片段)的甲基化水平的试剂用于制备子宫内膜癌诊断产品，以将子宫内膜癌患者与子宫良性病变患者有效区分，实现子宫内膜癌的微创诊断。

2、在本技术的第一方面，提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用；

3、所述目标区域包括：区域1或者区域1的部分区域，或/和，区域2或者区域2的部分区域；

4、以grch38.p14为参考，

5、区域1为chr6:27679636-27680274正链，

6、区域2为chr6:10390489-10390886正链。

7、在其中一些实施例方式中，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域1-1、区域1-2和区域1-3中的一个或者多个：区域1-1为chr6:27679695-27679811、区域1-2为chr6:27679919-27680065和区域1-3为chr6:27680099-27680254；

8、或/和，

9、所述区域2的部分区域选自如下定义的区域2-1、区域2-2和区域2-3中的一个或者多个：区域2-1为chr6:10390551-10390673、区域2-2为chr6:10390668-10390804和区域2-3为chr6:10390758-10390876。

10、在其中一些实施例方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量pcr法。

11、在其中一些实施例方式中，所述试剂包括用于检测目标区域的甲基化水平的核酸组合。

12、在其中一些实施例方式中，所述核酸组合通过所述亚硫酸氢盐测序法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对；

13、在其中一些实施例方式中，用于检测所述区域1甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.7和seq id no.8所示的检测引物对，或/和，用于检测所述区域2甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.9和seq id no.10所示的检测引物对。

14、在其中一些实施例方式中，所述核酸组合通过所述甲基化特异性荧光定量pcr法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。

15、在其中一些实施例方式中，用于检测所述区域1-1甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.11和seq id no.12所示的检测引物对和序列如seq id no.13所示的检测探针；用于检测所述区域1-2甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.14和seq idno.15所示的检测引物对和序列如seq id no.16所示的检测探针；用于检测所述区域1-3甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.17和seq id no.18所示的检测引物对和序列如seq id no.19所示的检测探针；用于检测所述区域2-1甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.20和seq id no.21所示的检测引物对和序列如seq id no.22所示的检测探针；用于检测所述区域2-2甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.23和seq idno.24所示的检测引物对和序列如seq id no.25所示的检测探针；或/和，用于检测所述区域2-3甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.26和seq id no.27所示的检测引物对和序列如seq id no.28所示的检测探针。

16、在其中一些实施例方式中，检测的样本类型包括细胞样本、血液样本或者组织样本。

17、在本技术的第二方面，提供一种子宫内膜癌诊断试剂盒，包括第一方面中所定义的试剂。

18、在其中一些实施例方式中，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、质控品、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、dna提取试剂和dna纯化试剂中的一种或者多种。

19、在其中一些实施例方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的一种或者多种。

20、相对于传统技术，本技术的有益效果包括：

21、本技术的发明人发现子宫内膜良性疾病和子宫内膜癌中chr6:27679636-27680274、chr6:10390489-10390886区域的甲基化状态截然不同，基于该发现，发明人以这些区域为目标区域，通过检测这些目标区域或其部分区域的甲基化水平，进而有效区分健康人、子宫内膜良性病变患者和子宫内膜癌症患者。并且，本技术对其他子宫恶性肿瘤(例如宫颈癌)的检出率不高，适用于宫颈脱离细胞样本，能够实现子宫内膜癌的简单、快捷、微创检测，灵敏度高，特异性强。

22、具体实施方式

23、下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

24、除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

25、除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

26、本技术所使用的术语“和/或”、“或/和”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本技术中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“a和/或b”包括a、b和a+b三种并列方案。又比如，“a，b，c，及/或，d”的技术方案，包括a、b、c、d中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括a、b、c、d的任意的和所有的组合，即包括a、b、c、d中任两项或任三项的组合，还包括a、b、c、d的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

27、本技术中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。

28、本技术中，“至少一者”、“至少一种”是指可以是所列项目中的任一项，或者是其中任意两种以上的组合。

29、本技术中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

30、本技术中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本技术的技术方案、解决本技术的技术问题、实现本技术预期的技术效果为准。

31、本技术中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本技术保护范围的限制。

32、本技术中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

33、本技术中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

34、本技术中，术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。

35、术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、dna复制、逆转录或其组合。dna的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。rna的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

36、术语“甲基化”为dna化学修饰的一种形式，能够在不改变dna序列的前提下，改变遗传表现。dna甲基化是指在dna甲基转移酶的作用下，在基因组cpg二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

37、术语“甲基化水平”指的是一段dna序列中一个或多个cpg二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较dna甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。可以理解，本文中被检测基因的目标区域是包括至少一个cpg二核苷酸(cg)的dna序列。

38、术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应pcr)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的pcr引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标dna分子的双链杂交或能与目标dna分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

39、术语“taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与dna上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，dna聚合酶(如taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个pcr循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

40、dna甲基化是在dna甲基转移酶的作用下，将一个甲基基团转移到胞嘧啶碱基的第5位碳原子上。肿瘤抑制基因启动子区域dna的甲基化是癌变过程中的重要事件，异常的dna甲基化通常发生在癌症的早期且稳定存在。dna的异常甲基化通常导致抑癌基因失活和癌基因的激活。鉴于此，发生甲基化改变的基因可以作为诊断癌变或癌前病变的分子标记物，具有一定的诊断价值。在进行癌症阴、阳性的判定过程中，筛选到合适的分子标记物并对其进行甲基化检测是非常关键的。

41、本技术的第一方面

42、本技术提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用；

43、所述目标区域包括：区域1或者区域1的部分区域，或/和，区域2或者区域2的部分区域；

44、以grch38.p14为参考，

45、区域1为chr6:27679636-27680274正链，

46、区域2为chr6:10390489-10390886正链。

47、可选地，所述目标区域为区域1或者区域1和区域2的组合。进一步地，所述目标区域为区域1和区域2的组合，区域1和区域2联合诊断早期子宫内膜癌的灵敏度高。

48、可选地，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域1-1、区域1-2和区域1-3中的一个或者多个：区域1-1为chr6:27679695-27679811、区域1-2为chr6:27679919-27680065和区域1-3为chr6:27680099-27680254；可选地，所述区域1的部分区域为区域1-2和区域1-3，进一步地，所述区域1的部分区域为区域1-2；

49、或/和，

50、所述区域2的部分区域选自如下定义的区域2-1、区域2-2和区域2-3中的一个或者多个：区域2-1为chr6:10390551-10390673、区域2-2为chr6:10390668-10390804和区域2-3为chr6:10390758-10390876；可选地，所述区域2的部分区域为区域2-2和区域2-3，进一步地，所述区域2的部分区域为区域2-2。

51、可选地，所述目标区域为区域1-1和区域2-1的组合，区域1-1和区域2-2的组合、区域1-1和区域2-3的组合、区域1-2和区域2-1的组合，区域1-2和区域2-2的组合、区域1-2和区域2-3的组合、区域1-3和区域2-1的组合，区域1-3和区域2-2的组合、区域1-3和区域2-3的组合。可选地，所述目标区域为区域1-2和区域2-1的组合、区域1-2和区域2-2的组合、区域1-2和区域2-3的组合、区域1-3和区域2-2的组合、区域1-3和区域2-3的组合。

52、可选地，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量pcr法。

53、可选地，所述试剂包括用于检测目标区域的甲基化水平的核酸组合。

54、可选地，所述核酸组合通过所述亚硫酸氢盐测序法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对；

55、可选地，用于检测所述区域1甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.7和seq id no.8所示的检测引物对，或/和，用于检测所述区域2甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.9和seq id no.10所示的检测引物对。

56、可选地，所述核酸组合通过所述甲基化特异性荧光定量pcr法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。

57、可选地，用于检测所述区域1-1甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.11和seq id no.12所示的检测引物对和序列如seq id no.13所示的检测探针；用于检测所述区域1-2甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.14和seq id no.15所示的检测引物对和序列如seq id no.16所示的检测探针；用于检测所述区域1-3甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.17和seq id no.18所示的检测引物对和序列如seq id no.19所示的检测探针；用于检测所述区域2-1甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.20和seqid no.21所示的检测引物对和序列如seq id no.22所示的检测探针；用于检测所述区域2-2甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.23和seq id no.24所示的检测引物对和序列如seq id no.25所示的检测探针；或/和，用于检测所述区域2-3甲基化水平的核酸组合包括序列如seq id no.26和seq id no.27所示的检测引物对和序列如seq id no.28所示的检测探针。

58、可选地，检测的样本类型包括细胞样本、血液样本或者组织样本。

59、本技术的第二方面

60、本技术提供一种子宫内膜癌诊断试剂盒，包括第一方面中所定义的试剂。

61、可选地，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、质控品、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、dna提取试剂和dna纯化试剂中的一种或者多种。

62、可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的一种或者多种。