一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肉毒杆菌神经毒素(bont)是一类由肉毒杆菌(clostridium botulinum)所产生的蛋白质毒素，它十分特异地靶向神经细胞，是自然界中已知的毒性最高的毒素。该毒素家族目前已知有七种亚型，其中a型被广泛用于疾病治疗和医美领域。
3.a型肉毒杆菌神经毒素(bont/a)在肉毒杆菌内被合成为单链多肽，该单链多肽通过蛋白水解酶在特定位点水解切割形成由二硫键连接在一起的两条多肽，该双链形式即为目标药物的活性形式。现有技术中的bont的生产是通过培养肉毒梭菌并随后分类和纯化梭菌神经毒素复合体来进行的。然而，以该方式生产bont是低效的且蛋白产量低。此外，肉毒梭菌是产芽孢细菌并因此需要专业的培养设备和装置，这些设备和装置是细菌(如大肠杆菌)培养中不需要的。因此，增多的bont应用导致需要替代性和/或改善的生产和纯化bont的方法。us 20080103098描述了一种生产双链形式重组bont蛋白的方法，该方法包括在大肠杆菌宿主细胞中表达重组核酸构建体。然而，所述方法需要在神经毒素的环结构域中插入特异性、非天然的(即非梭菌的)五肽序列；插入的五肽序列形成激活切割位)在细胞裂解后由内源性大肠杆菌蛋白酶切割。因此，us20080103098的方法指出，为实现优化的bont表达，必须通过插入非天然的切割位点对bont序列进行修饰。us 7132259描述了编码bont蛋白的重组核酸分子。然而，us 7132259的核酸分子经过修饰以使用非天然的切割位点代替天然的切割位点。因此，us 7132259的方法也指出，需要插入非天然的切割位点以进行优化的bont表达。以上两种方法均须通过对bont序列进行修饰引入非天然的切割位点才能实现具有活性的bont表达。
4.us 6495143描述了在大肠杆菌中单独表达并纯化单个h链和l链后在严格控制的条件下通过氧化型二硫键连接使h链和l链亚基结合形成活性双链bont的方法。然而该方法存在若干不足。具体而言，(1)难以大量表达和分离单个h链和l链，当h链不存在时，分离的l链在水溶液中完全不溶并且极易被蛋白酶水解降解。(2)单独的h链和l链在体外氧化以生成活性双链的效率不高，导致活性毒素的产量低，多数产品为无活性的非正确折叠或氧化形式的bont。(3)对含有正确折叠和氧化的h和l链的毒素进行纯化是困难的，将其与这些非活性形式和未反应的单独的h和l链分离也是困难的。
5.基于现有技术的不足，因此有必要研究一种生产具有较高生物活性的双链形式bont/a的方法，提高蛋白酶对单链多肽的切割效率，并降低生产成本。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种重组肉毒杆菌神经毒素，其插入外源蛋白酶识别位点，有效提高对单链多肽的切割效率，得到具有较高生物活性
的双链形式bont/a。
7.本发明的目的之二在于提供一种重组肉毒杆菌神经毒素的制备方法。
8.本发明的目的之三在于提供一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法。
9.本发明的目的之四在于提供一种双链式肉毒杆菌神经毒素。
10.本发明的目的之五在于提供一种双链式肉毒杆菌神经毒素的应用。
11.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
12.一种重组肉毒杆菌神经毒素，其氨基酸序列如seq id no:6所示。
13.进一步地，所述重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因的核酸序列包括seq id no:1-5所示。
14.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
15.一种重组肉毒杆菌神经毒素的制备方法，包括以下步骤：
16.1)将重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因插入质粒pet-15b中，得到重组pet-15b质粒；
17.2)将重组pet-15b质粒导入大肠杆菌中，培养并诱导表达，得到重组肉毒杆菌神经毒素。
18.进一步地，步骤2)中，具体操作为：将重组pet-15b质粒导入bl21(de3)或bl21(de3)plyss感受态细胞中，筛选获取表达重组肉毒杆菌神经毒素的单克隆菌株，将单克隆菌株接种至lb培养基中，培养至od值为0.4-0.6后，加入iptg诱导剂在25-37℃下诱导表达，得到重组肉毒杆菌神经毒素。
19.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
20.一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，切割所述的重组肉毒杆菌神经毒素制成。
21.进一步地，包括以下步骤：
22.s101，将重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因和外源蛋白酶插入质粒pcdfduet-1中，得到重组pcdfduet-1质粒；
23.s102，将重组pcdfduet-1质粒导入大肠杆菌中，培养并诱导表达，得到重组工程菌；
24.s103，将所述重组工程菌裂解，分离纯化，得到所述双链式肉毒杆菌神经毒素。
25.进一步地，所述外源蛋白酶为ev71-3c蛋白。
26.进一步地，包括以下步骤：
27.s201，构建表达重组肉毒杆菌神经毒素的工程菌；
28.s202，将所述工程菌裂解，得到含重组肉毒杆菌神经毒素的裂解液；
29.s203，将所述裂解液流经固定外源蛋白酶的反应柱，分离纯化，得到所述双链式肉毒杆菌神经毒素。
30.本发明的目的之四采用如下技术方案实现：
31.一种双链式肉毒杆菌神经毒素，由所述的双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法制得。
32.本发明的目的之五采用如下技术方案实现：
33.一种所述的双链式肉毒杆菌神经毒素的应用，所述双链式肉毒杆菌神经毒素在制
备皮肤治疗药物和医美产品中的应用。
34.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
35.本发明的一种重组肉毒杆菌神经毒素，其插入外源蛋白酶识别位点，有效提高对单链多肽的切割效率，得到具有较高生物活性的双链形式bont/a。
36.本发明的一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，通过高效切割所述的重组肉毒杆菌神经毒素制得双链式肉毒杆菌神经毒素。进一步地，在大肠杆菌中定量等比表达单链形式重组肉毒杆菌神经毒素和外源蛋白酶(ev71-3c蛋白)，外源蛋白酶可在大肠杆菌中切割单链形式重组肉毒杆菌神经毒素产生活性形式的双链式肉毒杆菌神经毒素，从而实现利用大肠杆菌进行一步生产。
附图说明
37.图1是现有技术中单链的a型肉毒杆菌神经毒素的结构示意图。
38.图2是本发明的seq1基因的在不同菌株下的诱导表达比较的凝胶电泳图；其中，m道为marker组，seq1道为含seq1基因的菌液组，seq1_s道为含seq1基因的上清液组，seq1_p道为含seq1基因的沉淀物组。
39.图3是本发明的seq2基因的在不同温度下的诱导表达比较的凝胶电泳图；其中，m道为marker组，seq2道为含seq2基因的菌液组，seq1_s道为含seq2基因的上清液组，seq2_p道为含seq2基因的沉淀物组。
40.图4是本发明的seq3基因的在不同温度下的诱导表达比较的凝胶电泳图；其中，m道为marker组，seq3道为含seq3基因的菌液组，seq3+iptg道为含seq3基因的菌液加入iptg液组，seq1_s道为含seq3基因的上清液组，seq3_p道为含seq3基因的沉淀物组。
41.图5是本发明的seq4基因的在不同温度下的诱导表达比较的凝胶电泳图。；其中，m道为marker组，seq4_lb道为lb培养基中含seq4基因的菌液组，seq4_p道为不同温度下含seq4基因的沉淀物组。
42.图6是本发明的各基因的菌株的诱导前后的电泳分析图。
43.图7是单链式bont/a的电泳分析图。
44.图8是本发明的重组肉毒杆菌神经毒素制得的双链式bont/a的电泳分析图。
具体实施方式
45.a型肉毒杆菌神经毒素(bont/a)在肉毒杆菌内被合成为单链多肽，该单链多肽通过蛋白水解酶在特定位点水解切割形成由二硫键连接在一起的两条多肽，该双链形式即为目标药物的活性形式。如图1所示，这两条链被称为重链(hc，其分子量为约100kda)和轻链(lc，其分子量为约50kda)。
46.本发明将单链多肽中的切割位点替换为外源蛋白酶(ev71-3c蛋白)的特异识别位点(氨基酸序列rtatvqgpsldfe)，从而有效提高位点切割的特异性。
47.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述。
48.实施例1
49.重组肉毒杆菌神经毒素的表达
50.1、根据双链式肉毒杆菌神经毒素(bont/a)的氨基酸序列，将目标药物中的切割位
点替换为外源蛋白酶(ev71-3c蛋白)的特异识别位点(氨基酸序列rtatvqgpsldfe)，设计得到的重组肉毒杆菌神经毒素的氨基酸序列如seq id no:6所示的。
51.2、通过密码子优化获得可在大肠杆菌中高效表达重组肉毒杆菌神经毒素的dna序列，得到的编码基因包括：seq1基因，核酸序列如seq id no:1所示；seq2基因，核酸序列如seq id no:2所示；seq3基因，核酸序列如seq id no:3所示；seq4基因，核酸序列如seq id no:4所示；seq5基因，核酸序列如seq id no:5所示。
52.3、以pet-15b载体为骨架，构建编码目标药物(重组肉毒杆菌神经毒素)的重组pet-15b质粒，具体步骤如下：
53.本实施例通过dna合成仪合成上述seq1基因、seq2基因、seq3基因和seq4基因的dna序列，利用限制性内切酶和t4dna连接酶将上述4条dna序列分别导入pet-15b表达载体，构建4个目标蛋白的重组pet-15b质粒：seq1-pet15b、seq2-pet15b、seq3-pet15b、seq4-pet15b；
54.4、将步骤(3)中获得的重组pet-15b质粒通过热激法导入bl21(de3)感受态细胞或bl21(de3)plyss感受态细胞，通过氨苄抗生素筛选获取表达bont/a单克隆菌株。
55.具体步骤如下：100ng质粒转化bl21(de3)、bl21(de3)plyss感受态细胞，4℃30min，加400ul无抗180rpm 50min，不离心直接取100ul涂布；挑单克隆，测序鉴定。
56.5、利用单克隆菌株表达单链形式bont/a，具体步骤如下：
57.1)小量诱导表达，确定目的蛋白表达
58.1.5ml离心管摇菌活化4h(50ul保藏菌液接入500ul培养基)，转接入含有抗性的lb培养基(1:100转接，小量诱导5ml)，4h后od值处于0.4-0.6之间时，取诱导前培养基1ml，剩余培养基加入1mm iptg(终浓度)，37℃、220rpm、7h诱导表达，取2ml培养基。小量诱导确定条件时，中间设置温度梯度，确定蛋白表达最适条件(25℃、30℃、37℃)。
59.取诱导前及诱导后离心得到菌液，直接加入40ul蛋白loading沸水煮样5min，跑普通sds-page凝胶电泳，考马斯染色，洗脱，结果如图2-5所示。
60.参照图2，将含seq1基因的菌株在25℃下分别在bl21(de3)感受态细胞和bl21(de3)plyss感受态细胞表达，其在140kda处出现明显的色带，bl21(de3)感受态细胞中表达的效果较佳；参照图3，将含seq2基因的菌株分别在30℃和37℃下在bl21(de3)plyss感受态细胞中表达，30℃下其蛋白表达较好；参照图4，将含seq3基因的菌株分别在30℃和37℃下在bl21(de3)plyss感受态细胞中表达，37℃下其蛋白表达较好；参照图5，将含seq4基因的菌株分别在25℃、30℃和37℃下在bl21(de3)plyss感受态细胞中表达，25℃下其蛋白表达较好。
61.2)大量诱导表达
62.按照表1的条件对含各dna序列的菌株进行大量诱导表达；具体为：1.5ml ep管摇菌活化4h(50ul保藏菌液接入500ul培养基)，转接入含有氨苄抗性的lb培养基(1:100转接(大量诱导250ml，或两个100ml)转接时，lb培养基中加入0.2g/100ml葡萄糖，180rpm，37℃3h后od值处于0.4-0.6之间时，冰上冷却10min，加入1mm iptg(终浓度)，150rpm、温度为小量诱导表达的最佳温度(seq1：25℃、seq2：30℃、seq3：37℃、seq4：25℃，6h后离心集菌。
63.表1
64.质粒表达载体培养基温度/℃
seq1-pet15bbl21(de3)lb+iptg25seq2-pet15bbl21(de3)plysslb+iptg30seq3-pet15bbl21(de3)plysslb+iptg37seq4-pet15bbl21(de3)plysslb+iptg25
65.参照图6，图6为各dna序列的菌液诱导前及诱导后的凝胶电泳图，下面部分为各凝胶电泳道的灰度分析，可以看出，诱导后的菌液在140kda处出现明显的色带，证明本发明的多个dna序列均可以在大肠杆菌中表达出单链形式的重组肉毒杆菌神经毒素。
66.实施例2
67.一步法生产双链式肉毒杆菌神经毒素
68.双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，包括以下步骤：
69.s101，将实施例1中的重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因和外源蛋白酶(ev71-3c蛋白)插入质粒pcdfduet-1中，得到重组pcdfduet-1质粒；
70.s102，将重组pcdfduet-1质粒导入大肠杆菌中，培养并诱导表达，得到重组工程菌；
71.具体为：将重组pcdfduet-1质粒通过热激法导入bl21(de3)感受态细胞或bl21(de3)plyss感受态细胞，通过氨苄抗生素筛选获取表达bont/a单克隆菌株。
72.将单克隆菌株活化后，转接入含有氨苄抗性的lb培养基，转接时，lb培养基中加入0.2g/100ml葡萄糖，180rpm，37℃3h后od值处于0.4-0.6之间时，冰上冷却10min，加入1mm iptg(终浓度)，150rpm、在适宜温度下(seq1：25℃、seq2：30℃、seq3：37℃、seq4：25℃)培养6h后，离心集菌。
73.s103，将所述重组工程菌超声裂解，分离纯化，得到所述双链式肉毒杆菌神经毒素。
74.将双链式a型肉毒杆菌神经毒素进行凝胶电泳测试，以未经过基因重组的单链式a型肉毒杆菌神经毒素作为对照组，结果如图7-8所示。
75.参照图7，可以看出，经过iptg诱导后的a型肉毒杆菌神经毒素上清液组(bont/a+iptg-s)在140kda出现明显的带条；参照图8，经过iptg诱导后的a型肉毒杆菌神经毒素上清液组(bont/a+iptg-s)和a型肉毒杆菌神经毒素沉淀物组(bont/a+iptg-p)在50kda和100kda出现明显的带条，说明本发明的重组肉毒杆菌神经毒素可利用ev71-3c蛋白特异性酶解得到双链式bont/a，也证明本发明的制备方法可实现双链式bont/a的一步生产，简化生产工艺。
76.本实施例在大肠杆菌中定量等比表达单链形式重组肉毒杆菌神经毒素和外源蛋白酶(ev71-3c蛋白)，外源蛋白酶可在大肠杆菌中切割单链形式重组肉毒杆菌神经毒素产生活性形式的双链式肉毒杆菌神经毒素，从而实现利用大肠杆菌进行一步生产，简化生产工艺。
77.实施例3
78.两步法生产双链式肉毒杆菌神经毒素
79.s201，构建实施例1的表达重组肉毒杆菌神经毒素的工程菌；
80.s202，将所述工程菌裂解，得到含重组肉毒杆菌神经毒素的裂解液；
81.s203，将所述裂解液流经固定外源蛋白酶(ev71-3c蛋白)的反应柱，分离纯化，得
到所述双链式肉毒杆菌神经毒素。
82.本实施例先诱导表达重组肉毒杆菌神经毒素后，将其与ev71-3c蛋白充分接触进行酶切，有利于提高工艺的灵活性，提高产品纯度，并且固定化蛋白酶反应柱可以重复使用，降低生产成本。
83.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。