一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、麦角硫因(ergothioneine，egt)是一种具有广阔应用前景的高附加值氨基酸衍生物，具有独特的生物学功能，特别是作为优良的抗氧化剂引起了人们广泛的关注。麦角硫因可广泛应用于食品保健、化妆品、医药和生物技术等领域。

2、麦角硫因的制备方法包括天然生物提取法、化学合成法和生物合成法。当前的商业生产麦角硫因的方法主要依赖于从天然生物中提取或化学合成，这两种方法具有成本高、产率低等问题。生物合成法中的微生物发酵法相比于其他方法，具有原料成本低、生产工艺简单、安全环保可持续生产等优势，是大规模工业生产的理想方式。然而，天然合成途径弱，前体物组氨酸，腺苷蛋氨酸和半胱氨酸的协同供应困难等制约了麦角硫因的合成。

3、为了获得高效的麦角硫因生产菌株，研究者们已做出了诸多尝试。tanaka等(tanaka n，kawano y，satoh y，et al.gram-scale fermentative production ofergothioneine driven by overproduction of cysteine in escherichiacoli.scientific reports，2019，9(1)：1895.)以大肠杆菌为出发菌，导入重组质粒pqe1a-egtabcdemsm,p15a-sera*/cyse*,敲除基因metj，所获得的重组菌株分批补料发酵216h后，麦角硫因产量可以达到1.31g/l。van der hoek等(van der hoek s a，darbani b，zugaj ke，et al.engineering the yeast saccharomyces cerevisiae for the production ofl-(+)-ergothioneine.frontiers in bioengineering and biotechnology，2019，7：262.)在酿酒酵母中整合了粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶ncegt1和麦角菌来源的麦角硫因合成酶cpegt2编码基因，所获菌株在1l反应器中分批补料发酵84h后麦角硫因产量达到598mg/l；van der hoek sa等在此基础上，进一步利用有毒的组氨酸类似物筛选tra抗性菌株，基因组整合单拷贝的met14基因并敲除spe2基因，所获菌株在1l反应器分批补料发酵160h后，产量提高到了2.39g/l，且无需添加氨基酸前体(van der hoek s a，rusnak m，wang g，et al.engineering precursor supply for the high-level production ofergothioneine in saccharomyces cerevisiae.metabolic engineering，2022，70：129-142.)。chen等(chen z，he y，wu x，et al.toward more efficient ergothioneineproduction using the fungal ergothioneine biosynthetic pathway.microbial cellfactories，2022，21(1)：76.)在大肠杆菌中共表达里氏木霉来源的麦角硫因合成基因tregt1和tregt2，所得菌株通过2l罐分批补料发酵，培养143h后麦角硫因产量达到4.34g/l。康振等(陈佳敏,王阳,堵国成,康振.优化前体供给与细胞膜通透性强化大肠杆菌合成麦角硫因.食品与生物技术学报,2022,41(08):43-52.)在大肠杆菌中通过质粒异源成功表达了耻垢分枝杆菌来源的egtbdce基因簇与粟酒裂殖酵母来源的egt1基因，同时强化表达了耻垢分枝杆菌的谷氨酰半胱氨酸连接酶egta与麦角硫因合成所需前体氨基酸代谢途径中的关键酶，包括天冬氨酸激酶thra和磷酸甘油酸脱氢酶sera，最后通过发酵工艺的优化，所得菌株在3l发酵罐发酵108h，麦角硫因产量可以达到2.01g/l。中国专利申请cn114854660a在大肠杆菌中游离表达外源麦角硫因合成基因rregtb和rregtc，将hisa，hisf，cyse，nrdh，cysp，meth，mtn，lux，metk，metf的启动子替换为j23100启动子，利用crispr/cas9基因编辑技术敲除基因组上yham，tnaa，tolc，metj，mgl，yjeh，yeas基因；最终所得菌株经摇瓶发酵48h，可以产110mg/l的麦角硫因，通过将补料培养基的流速调节菌株生长的速度，溶氧控制实现了麦角硫因的高效合成，菌株od600最终达到110，培养77h麦角硫因产量达到了7g/l。

4、尽管进行了诸多尝试，但是现有麦角硫因生产菌株的性能仍较低，现阶段利用微生物发酵法生产麦角硫因仍存在发酵周期长，产量低，生产强度低的问题，并且需要额外添加大量的氨基酸前体，导致生产成本很高，不能满足大规模工业生产要求。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明的目的是构建一种生产麦角硫因的大肠杆菌基因工程菌株，该菌株对麦角硫因合成模块、前体物组氨酸、半胱氨酸和腺苷蛋氨酸合成模块进行了系统性改造，实现大肠杆菌中麦角硫因的高效、稳定生产。

2、为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种基因工程菌，该基因工程菌以大肠杆菌为宿主，异源过表达microcoleus sp.pcc 7113来源的egtd基因，methylobacterium pseudosasicola来源的egtb基因，neurospora crassa来源的egt2基因，corynebacterium glutamicum的atp转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisg*；并且过表达hisdbchafi基因簇，丝氨酸转乙酰酶突变体cyse(m201r)编码基因，磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体sera(h344a/n364a)编码基因，腺苷蛋氨酸合酶突变体metk(i303v)编码基因；并且不表达色氨酸酶基因tnaa。

4、第二方面，本发明提供了如上所述的基因工程菌的构建方法，包括：在宿主大肠杆菌中引入microcoleus sp.pcc 7113来源的egtd基因，methylobacterium pseudosasicola来源的egtb基因，neurospora crassa来源的egt2基因，corynebacterium glutamicum的atp转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisg*并过表达；并且过表达hisdbchafi基因簇，丝氨酸转乙酰酶突变体cyse(m201r)编码基因，磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体sera(h344a/n364a)编码基因，腺苷蛋氨酸合酶突变体metk(i303v)编码基因；并且将色氨酸酶基因tnaa敲除或失活。

5、第三方面，本发明提供了如上所述的基因工程菌在高效生产麦角硫因中的应用。

6、第四方面，本发明提供了利用如上所述的基因工程菌生产麦角硫因的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产麦角硫因；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述麦角硫因。

7、本发明的有益效果如下：

8、本发明以大肠杆菌为出发菌株，经过对麦角硫因的合成模块、前体物组氨酸、半胱氨酸和腺苷蛋氨酸合成模块进行系统的代谢工程改造得到一株遗传背景清晰，不携带质粒，能稳定高效生产麦角硫因的基因工程菌株egt11，该菌株在不用添加l-组氨酸、l-半胱氨酸和l-蛋氨酸的条件下，摇瓶发酵24h可生产麦角硫因350mg/l；在2l发酵罐上进行分批补料发酵，培养60h可生产麦角硫因7.2g/l，未有其它副产物的显著积累。本发明提供的麦角硫因发酵生产方法，麦角硫因产量和生产强度为目前报道的最高水平，并且发酵过程中无需添加l-组氨酸和l-半胱氨酸，可显著降低生产成本。