本发明属于药物化合物，具体涉及磺酸化四糖结构化合物、其制备方法，以及其治疗血管内皮损伤活性与制药应用。
背景技术：
1、乙酰肝素酶(heparanase)包括乙酰肝素酶-1(heparanase,hpse-1)和乙酰肝素酶-2(heparanase,hpse-2)两个亚型，其中乙酰肝素酶-1是具有切割硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,hs)生物活性的亚型并且是本文研究的重点因此用乙酰肝素酶(heparanase)简化替代[105]。乙酰肝素酶由nakajima课题组于1984年首次报道，是唯一能够以独特的方式裂解hspg的糖胺聚糖hs侧链的哺乳动物葡萄糖醛酸内切酶。
2、在正常的生理条件下，乙酰肝素酶在胎盘和某些血液传播细胞(包括血小板，嗜中性粒细胞，肥大细胞和淋巴细胞)中高水平表达，在其他人体组织中表达水平较低。在病理条件下，乙酰肝素酶的表达在多种恶性肿瘤中得到增强，另外乙酰肝素酶在炎症性疾病中的内皮和上皮细胞也存在过表达现象。乙酰肝素酶对hs的酶促降解和重塑会改变组织的完整性和状态，并极大地影响各种生理和病理过程，这些过程包括组织修复、细胞黏附、增殖、存活和分化、肿瘤发展和转移、血管生成、神经突生长、炎症和自身免疫等。
3、hs是一种高度磺酸化的异质多糖，乙酰肝素酶可切割β-d-葡萄糖醛酸与随后的n-(磺酸化)-d-葡萄糖胺之间的糖苷键，释放出具有明显分子量的糖类产物使其仍然能够结合蛋白质配体。因此磺酸化的hs衍生物是一类具有研究前景的小分子乙酰肝素酶抑制剂。
技术实现思路
1、本发明提供了一种磺酸化四糖结构化合物，其具有有价值的药理性质，特别是抑制乙酰肝素酶活性。
2、本发明还进一步提供了所述磺酸化四糖结构化合物的制备方法。
3、具有式i结构的化合物，或者其立体异构体、药物可接受的盐或多晶型从左到右四个单糖分别用a、b、c、d表示：
4、
5、其中：
6、r1相同或不同，独立地选自oso3y或nhso3y；
7、r2、r3、r4和r5相同或不同，独立地选自氢或so3y；
8、r6独立的选自氢、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的卤代烷烃或1-4个碳原子的烷苯基；
9、y相同或不同，独立地选自氢或一价阳离子，所述一价阳离子包括但不限于na+、k+、li+或nh4+等；
10、单糖a选自磺酸化或未磺酸化葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸，r表示单糖a糖环上羟基的取代基，r包括糖环2位取代基or7、3位取代基or8和4位取代基or9；
11、表示糖苷键构型为α或β构型；
12、优选，r1相同，均为nhso3y；
13、优选，r2不同，选自氢或so3y，b糖r2选自so3y，d糖r2选自氢；
14、优选，r3相同，均为so3y；
15、优选，r4选自氢；
16、优选，r5选自so3y
17、优选，r6为氢或1-4个碳原子的烷基；
18、优选，所述每个y都相同，选自氢，na+，k+，li+或nh4+。
19、在本发明的一个实施方案中，其中单糖a选自葡萄糖醛酸，其具有式ii结构：
20、
21、根据本发明的一个实施方案，具有式ii所示结构的示例性化合物包括表1中阐述的化合物及其药物可接受的盐或其溶剂合物：
22、表1
23、
24、在本发明的一个实施方案中，其中单糖a选自艾杜糖醛酸，其具有式iii结构：r7、r8和r9相同或不同，独立地选自氢或so3y。
25、根据本发明的一个实施方案，具有式iii所示结构的示例性化合物包括表2中阐述的化合物及其药物可接受的盐或其溶剂合物：
26、表2
27、
28、本发明还提供式i、ii和iii化合物的制备方法。
29、根据本发明，所述式i、ii和iii由全保护四糖中间体
30、化合物，依次经过脱羟基保护基，o-磺酸化，任选的叠氮还原反应，最后进行n-磺酸化得到。
31、所述全保护四糖化合物式iv或式v中，r21、r31、r41、r51、r71、r81和r91可以相同或不同，独立地选自氢、氯乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、特戊酰基、苄基、对甲氧基苄基。
32、根据本发明的一个实施方案，具有式iv或式v所示结构的示例性化合物包括表3中阐述的化合物及其药物可接受的盐或其溶剂合物：
33、表3
34、
35、
36、在本发明的一个实施方式中，本发明采用所述反应方法，合成a糖为葡萄糖醛酸，r1＝nhso3y，b糖r2＝h或so3y，d糖r2＝h，r3＝r5＝r9＝so3y，r4＝r7＝h，r6＝me，r8＝h或so3y的式i化合物。所述合成方法以b糖r21＝ac或bn，d糖r21＝bn，r31＝r91＝ac，r51＝bz，r41＝r71＝bn，r81＝ac或bn的式iv全保护四糖化合物，依次经过脱羟基保护基，o-磺酸化，任选的叠氮还原反应，最后进行n-磺酸化得到。在本发明的一个具体实施例中，本发明采用所述方法以全保护四糖cv025-1、cv026-1、cv027-1、cv028-1、cv029-1和cv030-1为原料分别合成对应的磺酸钠化四糖cv025、cv026、cv027、cv028、cv029和cv030：
37、
38、在本发明的另一个实施方式中，本发明采用所述反应方法，合成a糖为艾杜糖醛酸，r1＝nhso3y，b糖r2＝so3y，d糖r2＝h，r3＝r5＝r7＝r9＝so3y，r4＝r8＝h，r6＝me的式i化合物。所述合成方法以b糖r21＝ac，d糖r21＝bn，r31＝r71＝ac，r51＝r91＝bz，r41＝r81＝bn，式iv全保护四糖化合物，依次经过脱羟基保护基，o-磺酸化，任选的叠氮还原反应，最后进行n-磺酸化得到。在本发明的一个具体实施例中，本发明采用所述方法以全保护四糖cv031-1为原料分别合成对应的磺酸钠化四糖cv031：
39、
40、在本发明的一个实施方式中，全保护四糖中间体iv由二糖中间体7和二糖受体8进行糖基化偶联获得，反应式如下：
41、其中x为适合与其他受体反应的离去基团，包括但不限于三氯乙酰亚胺酯、硫苷、卤素等，优选x选自三氯乙酰亚胺酯。
42、在本发明的一个实施方式中，全保护四糖中间体v由二糖中间体9和二糖受体8进行糖基化偶联获得，反应式如下：
43、其中x为适合与其他受体反应的离去基团，包括但不限于三氯乙酰亚胺酯、硫苷、卤素等，优选x选自三氯乙酰亚胺酯。
44、所述二糖中间体7可由单糖中间体10和11通过糖基化偶联后再开环获得，反应式如下：
45、
46、所述二糖中间体9可由单糖中间体11和13通过糖基化偶联后再开环获得，反应式如下：
47、
48、上述制备方法中用到二糖受体8和单糖中间体11可以按照本领域已知的合成方法制备，例如：preactivation-based,iterative one-pot synthesis of anticoagulantpentasaccharide fondaparinux sodium.org.chem.front.,2019,6,3116。
49、本发明还提供上述合成方法中的各中间体及其制备方法。
50、一种单糖中间体10，其结构如下：其中优选r71为苄基，r81为苄基或乙酰基，r91为乙酰基或氯乙酰基，x为溴或硫苷。在本发明的一个实施方式中，所述单糖中间体10的r71和r81均为苄基，r91为乙酰基，x为硫苷，命名为10-1，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，所述单糖中间体10的r71为苄基，r81为乙酰基，r91为氯乙酰基，x为溴，命名为10-2，结构如下：
51、所述单糖中间体10-1和10-2的制备方法如下：
52、
53、一种单糖中间体11，其结构如下：其中优选r21为乙酰基或氯乙酰基。在本发明的一个实施方式中，所述单糖中间体11的r21为乙酰基，命名为11-1，其结构如下：本发明的另一个实施方式中，所述单糖中间体11的r21为苄基，命名为11-2，其结构如下：单糖中间体11-1的制备可以按照本领域已知的合成方法制备，例如：preactivation-based,iterative one-pot synthesis of anticoagulantpentasaccharide fondaparinux sodium.org.chem.front.,2019,6,3116。
54、一种单糖中间体13，其结构如下：其中优选r71、r81和r91为苄基或苯甲酰基，x为溴或硫苷。在本发明的一个实施方式中，所述单糖中间体13的r71和r91均为苯甲酰基，r81为苄基，x为硫苷，命名为13-1，结构如下：
55、所述单糖中间体13-1的制备方法如下：
56、
57、一种二糖中间体8，其结构如下：在本发明的一个实施方式中，所述二糖中间体8的r21和r41均为苄基，r31为乙酰基，r51均为苯甲酰基，命名为8-1，结构如下：单糖中间体8-1的制备可以按照本领域已知的合成方法制备，例如：preactivation-based,iterative one-pot synthesis ofanticoagulant pentasaccharide fondaparinux sodium.org.chem.front.,2019,6,3116。
58、一种二糖中间体12，其结构如下：其中优选r21和r81为乙酰基或苄基，r71为苄基，r91为乙酰基或氯乙酰基。在本发明的一个实施方式中，所述二糖中间体12的r21和r91均为乙酰基，r71和r81均为苄基，命名为12-1，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，所述二糖中间体12的r21、r81和r91均为乙酰基，r71为苄基，命名为12-2，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，所述二糖中间体12的r21、r71和r81均为苄基，r91均为乙酰基，命名为12-3，结构如下：
59、一种二糖中间体7，其结构如下：其中优选r31和r91为乙酰基，r71为苄基，r21和r81为苄基或乙酰基，x为三氯乙酰亚胺酯或硫苷。在本发明的一个实施方式中，所述二糖中间体7的r21、r31和r91均为乙酰基，r71和r81均为苄基，x为三氯乙酰亚胺酯，命名为7-1，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，所述二糖中间体7的r21、r31、r81和r91均为乙酰基，r71为苄基，x为三氯乙酰亚胺酯，命名为7-2，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，所述二糖中间体7的r31、r81和r91均为乙酰基，r21和r71为苄基，x为三氯乙酰亚胺酯，命名为7-3，结构如下：
60、所述二糖中间体7-1的制备方法如下：
61、
62、所述二糖中间体7-2的制备方法如下：
63、
64、所述二糖中间体7-3的制备方法如下：
65、
66、一种二糖中间体14，其结构如下：其中优选r21、r71和r91为乙酰基或苯甲酰基，r81为苄基。在本发明的一个实施方式中，所述二糖中间体14的r21为乙酰基，r71和r91均为苯甲酰基，r81为苄基，命名为14-1，结构如下：
67、一种二糖中间体9，其结构如下：其中优选r21、r31、r71和r91为乙酰基或苯甲酰基，r81为苄基，x为三氯乙酰亚胺酯或硫苷。在本发明的一个实施方式中，所述二糖中间体9的r21和r31为乙酰基，r71和r91均为苯甲酰基，r81为苄基，x为三氯乙酰亚胺酯，命名为9-1，结构如下：
68、所述二糖中间体9-1的制备方法如下：
69、
70、一种全保护四糖iv，其结构如下：
71、其中优选r31、r51和r91为乙酰基或苯甲酰基，r41和r71为苄基，r21和r81为乙酰基或苄基，糖苷键构型为α或β构型。在本发明的一个实施方式中，所述全保护四糖iv的b糖r21为乙酰基，d糖r21为苄基，r31和r91为乙酰基，r41、r71和r81为苄基，r51为苯甲酰基，糖苷键构型为β构型，即为化合物cv025-1；在本发明的另一个实施方式中，所述全保护四糖iv的b糖r21为乙酰基，d糖r21为苄基，r31和r91为乙酰基，r41、r71和r81为苄基，r51为苯甲酰基，糖苷键构型为α构型，即为化合物cv026-1；在本发明的另一个实施方式中，所述全保护四糖iv的b糖r21为乙酰基，d糖r21为苄基，r31、r81和r91为乙酰基，r41和r71为苄基，r51为苯甲酰基，糖苷键构型为β构型，即为化合物cv027-1；在本发明的另一个实施方式中，所述全保护四糖iv的b糖r21为乙酰基，d糖r21为苄基，r31、r81和r91为乙酰基，r41和r71为苄基，r51为苯甲酰基，糖苷键构型为α构型，即为化合物cv028-1；在本发明的另一个实施方式中，所述全保护四糖iv的b糖和d糖r21均为苄基，r31、和r91为乙酰基，r41、r71和r81为苄基，r51为苯甲酰基，糖苷键构型为β构型，即为化合物cv029-1；在本发明的另一个实施方式中，所述全保护四糖iv的b糖和d糖r21均为苄基，r31、和r91为乙酰基，r41、r71和r81为苄基，r51为苯甲酰基，糖苷键构型为α构型，即为化合物cv030-1。
72、一种全保护四糖v，其结构如下：
73、其中优选r21为乙酰基或苄基，r31、r51、r71和r91为乙酰基或苯甲酰基，r41和r81为苄基。在本发明的一个实施方式中，所述全保护四糖v的b糖r21为乙酰基，d糖r21为苄基，r31为乙酰基，r41和r81为苄基，r51、r71和r91为苯甲酰基，即为化合物cv031-1。
74、所述全保护四糖cv025-1～cv030的制备方法相似并且反应所用二糖受体相同，不同二糖三氯乙酰亚胺酯供体分别与二糖受体8-1发生糖基化偶联获得相应结构的全保护四糖，制备方法如下：
75、
76、一种四糖化合物1，其中优选r21和r81为苄基或氢。r41和r71为苄基。在本发明的一个实施方式中，b糖r21为氢，d糖r21为苄基，r41、r71和r81均为苄基，命名为1-1，结构如下：
77、在本发明的另一个实施方式中，b糖r21为氢，d糖r21为苄基，r41和r71均为苄基，r81为氢，命名为1-2，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，r21、r41、r71和r81均为苄基，命名为1-3，结构如下：
78、
79、一种四糖化合物2，其中r21、r41和r71为苄基，r211和r811分别为氢、苄基或so3y，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，r21、r41、r71和r811均为苄基，r211为so3y，y为na+，命名为2-1，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，r21、r41和r71均为苄基，r211和r811为so3y，y为na+，命名为2-2，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，r21、r41、r71、r211和r811均为苄基，y为na+，命名为2-3，结构如下：
80、一种四糖化合物3，其中r21、r41和r71为苄基，r211和r811为氢或so3y，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，r21、r41、r71和r811均为氢，r211为so3y，y为na+，命名为3-1，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，r21、r41和r71均为氢，r211和r811为so3y，y为na+，命名为3-2，结构如下：在本发明的另一个实施方式中，r21、r41、r71、r211和r811均为氢，y为na+，命名为3-3，结构如下：
81、
82、一种四糖化合物ii-1，其中r2和r8分别为氢或so3y，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，r2为so3y，r8为氢，y为na+，糖苷键构型为β构型，即为化合物cv025。在本发明的另一个实施方式中，r2为so3y，r8为氢，y为na+，糖苷键构型为α构型，即为化合物cv026。在本发明的一个实施方式中，r2和r8为so3y，y为na+，糖苷键构型为β构型，即为化合物cv027。在本发明的另一个实施方式中，r2和r8为so3y，y为na+，糖苷键构型为α构型，即为化合物cv028；在本发明的另一个实施方式中，r2和r8为氢，y为na+，糖苷键构型为β构型，即为化合物cv029；在本发明的另一个实施方式中，r2和r8为氢，y为na+，糖苷键构型为α构型，即为化合物cv030。
83、所述四糖化合物cv025和cv026的制备方法如下：
84、
85、所述四糖化合物cv027和cv028的制备方法如下：
86、
87、所述四糖化合物cv029和cv030的制备方法如下：
88、
89、一种四糖化合物4，其中r21、r41和r81为苄基，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，r21、r41、和r81均为苄基，y为氢，命名为4-1，结构如下：
90、一种四糖化合物5，其中r21、r41和r81为苄基，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，r21、r41、和r81均为苄基，y为na+，命名为5-1，结构如下：
91、一种四糖化合物6，其中r21、r41和r81为氢，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，r21、r41、和r81均为氢，y为na+，命名为6-1，结构如下：
92、一种四糖化合物iii-1，y选自氢、na+、k+、li+或nh4+。在本发明的一个实施方式中，y为na+，即为化合物cv031。
93、所述化合物cv031的制备方法如下：
94、
95、除特别说明之外，上述制备方法中已有文献报道的化合物均可以采用本领域已知的反应方法和条件进行。
96、本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的式i化合物或其溶剂化物作为活性成分，任选地还含有一种或多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、ph调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。
97、在本发明的一种实施方式中，所述药物组合物用于治疗或预防乙酰肝素酶过表达引起的疾病如炎症性疾病、癌症、脓毒症等，主要作用是抑制乙酰肝素酶活性。
98、所述药物组合物中含有式i化合物的量(以式i化合物计)为0.1-1000mg，优选1-500mg，更优选为5-100mg。
99、所述药物组合物中式i化合物(以式i化合物计)占药物组合物的质量百分比为0.01％-95％，根据剂型不同例如可以为0.1％-10％，0.3～5％，或者10％-90％，优选为20％-80％，更优选为30％-70％等含量范围。
100、所述药物组合物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径注射给药。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。例如所述药物组合物可以为注射液，式i化合物在注射液中的浓度可以为1-15mg/ml，例如5mg/ml、10mg/ml、12.5mg/ml等。
101、所述药物组合物的施用途径包括但不限于：口服的；含服的；舌下的；透皮的；肺的；直肠的；肠胃外的，例如，通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌内的、静脉内的；通过植入储库或储液器。
102、式i化合物的施用剂量(以式i化合物计)将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，每天给药一次、每两天给药一次、每三天给药一次、每四天给药一次，或者总日剂量以每天两次、三次或四次的分开剂量施用。式i化合物用药量(以式i化合物计)为0.01-100mg/kg/天，优选为0.1-10mg/kg/天，例如为0.5mg/kg/天，1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天等等。
103、所述药物组合物可以和其他的治疗剂联合应用给药或者制成组合药物。所述其他治疗剂根据疾病和病症类型不同，可以是其他的治疗癌症或脓毒症的药物等。
104、本发明式i化合物具有明确且高效的抑制乙酰肝素酶活性的效果，不具有细胞毒性。因此在治疗用途的同时保证用药的安全性。式i化合物结构明确，利于制备和质量控制。