一种间充质干细胞微球及其制备和在制备神经性勃起功能障碍药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种间充质干细胞微球及其制备和在制备神经性勃起功能障碍药物中的应用。


背景技术：

2.现有研究表明，将msc(间充质干细胞)培养成三维干细胞微球可以显著激活其旁分泌功能，对于提高msc治疗潜能具有重要意义。目前，无支架三维干细胞微球的经典方法为悬滴培养法，通过将细胞悬液滴到培养基底上，约30ul-50ul/滴，倒置使液滴下垂，在重力的作用下使细胞在液滴顶端形成微球(参见图1)，这种方法操作极其繁琐费时，每一液滴只能形成一个微球，一般一个10cm直径的细胞培养皿大约只能培养20个～30个液滴，即形成20个～30个微球，而这些液滴的制备时间需要数分钟，制备1千个液滴大概需要数小时，效率很低，而且后续干细胞微球的回收同样麻烦。此外，作为富含细胞因子的三维培养条件培养基，具有重要应用价值，但回收率非常低，为提高干细胞微球的规模化培养，有研究者研发了3d悬滴培养板，其基于常规96孔板的原理(参见图2)，在96孔板类似的基底上构建96个可制备悬滴的孔道，可通过排枪进行批量操作，在一定程度上提高了悬滴培养的数量，降低了操作的繁琐性，但依然明显存在操作繁琐、效率较低的问题。在最新的研究中，通过改变悬滴培养板的设计，在培养板底设计大量的微阵列凹坑的方式，使细胞沉降在凹坑中形成微球，较上述商业化悬滴培养板干细胞微球培养产率提高十倍，操作也相对简化，然而，该培养方式的规模化水平仍然有限，且该培养方式与前述方法均存在细胞接种后不能轻易移动培养板，更不能中间更换或回收培养液，以免形成的干细胞微球相互聚集的问题，相应方法只能在培养的结束点回收一次培养液与干细胞微球，可获得的细胞条件培养液非常有限。因此，发展一种规模化培养水平更高、操作更为简便且可连续获取大量条件培养液的间充质干细胞微球培养方法成为现阶段亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

3.本发明针对现有技术不足，提出一种间充质干细胞微球及其制备和在制备神经性勃起功能障碍药物中的应用。本发明的技术方案主要包括：利用多隔室同步旋转生物反应器的三维规模化培养间充质干细胞微球，该方法包括培养细胞、准备三维细胞培养条件和培养三维细胞，方法简单、方便、经济、规模化程度高，还可以显著提高工作效率，减少培养时摸索最优条件的时间，且该方法可显著提高msc旁分泌功能。具体包括：
4.本发明的目的之一，是提供一种间充质干细胞微球的制备方法，包括：
5.s1、培养细胞，将间充质干细胞放入含培养液的培养皿中，将所述培养皿放入37℃、5％co2的培养箱中培养，当所述培养皿中的细胞密度达到80％-90％时进行传代，消化离心重悬后，得到用于三维细胞培养的细胞悬浮液；
6.s2、准备三维细胞培养条件，将所述细胞悬浮液计数，调节细胞浓度为0.2
×
105/
ml-1.2
×
105/ml；
7.s3、培养三维细胞，将所述细胞悬浮液移至低贴壁细胞培养皿中，将所述培养皿放置于具有倾斜角的可变速三维旋转摇床，调节摇床转速为7rpm-30rpm，放置于培养箱中培养，培养后得到三维干细胞微球。
8.进一步地，所述制备过程利用多隔室同步旋转生物反应器完成，所述多隔室同步旋转生物反应器下方为固定倾斜角机械三维旋转摇床，上方为可承载培养皿的平行同步隔室，所述摇床外侧设置有保护罩。
9.进一步地，所述培养液为体积百分含量5％-15％的胎牛血清的dmem培养液。
10.进一步地，所述s2中，所述细胞浓度优选为0.6
×
105/ml-1.0
×
105/ml。
11.进一步地，根据所述细胞浓度可制备不同规格的间充质干细胞微球。
12.进一步地，所述摇床转速优选为8rpm-20rpm；所述培养时间为24h-72h。
13.进一步地，所述培养皿直径为35mm-150mm的细胞培养皿。
14.进一步地，所述制备方法为间充质干细胞微球无支架的三维规模化的培养方法。
15.本发明的目的之二，是提供一种间充质干细胞微球，包括：
16.所述间充质干细胞微球根据所述间充质干细胞微球的制备方法制备得到。
17.本发明的目的之三，是提供一种间充质干细胞微球在制备神经性勃起功能障碍药物中的应用，包括：
18.所述微球根据所述间充质干细胞微球的制备方法制备得到，或为所述微球。
19.与现有技术相比，本发明提供了一种间充质干细胞微球及其制备和在制备神经性勃起功能障碍药物中的应用，具备以下有益效果：
20.1.本发明提出了一种无支架的三维规模化培养间充质干细胞微球的方法，该方法可简便、规模化进行间充质干细胞三维培养；同时，该方法可以得到的培养物活度高；
21.2.本发明提供了一种用于无支架细胞三维培养领域研究的模型，本发明中的模型不仅方法简单、方便、经济、规模化程度高，还可以显著提高工作效率，减少培养时摸索最优条件的时间；且该方法可显著提高msc旁分泌功能。
附图说明
22.图1示出了现有技术中的悬滴培养法示意图，其中，图1a为悬滴培养法侧面示意图；图1b为悬滴培养法俯视图及放大图(标尺＝500μm)；
23.图2示出了现有技术中的3d悬浮培养板法示意图；
24.图3示出了本发明实施例的一种多隔室同步旋转生物反应器示意图；
25.图4示出了本发明实施例的一种动态培养细胞微球所用低贴壁细胞培养皿的俯视图和侧视图；
26.图5示出了本发明实施例的一种三维摇床培养脂肪来源msc图；其中，图5a条件为8rpm，1
×
105/ml，48h；图5b条件为12rpm，1
×
105/ml，48h；图5c条件为16rpm，1
×
105/ml，48h；图5d条件为20rpm，1
×
105/ml，48h；
27.图6示出了本发明实施例的一种三维摇床培养脂肪msc微球与2d培养msc的细胞因子基因表达比较图；其中，图6a为培养过程的细胞接种浓度和培养时间比较实验图；图6b为培养过程摇床转速比较实验图；
28.图7示出了本发明实施例的一种条件培养基用于划痕实验huvec示意图；其中，图7a为huvec培养基；图7b为50％ huvec培养基+50％adsc 2d培养48h条件培养基；图7c为50％ huvec培养基+50％adsc 1
×
105/ml摇床培养48h条件培养基；图7d为a、b、c条件的比较图(**，与a组比较，p＜0.01；&：与b组比较，p＜0.05)；
29.图8示出了本发明实施例的一种将本发明制备的微球用于sd大鼠神经性勃起功能障碍(ed)的测定图；其中，5v电刺激下大鼠阴茎icpmax/map比值(n＝6)；图8a为icp、map、icp/map的代表性原始记录；图8b为在5v电刺激后，假手术组(sham)、神经损伤组(bcni)、脂肪干细胞治疗组(t1)、脂肪干细胞微球治疗组(t2)的icpmax/map变化统计情况图，每个条带均表示(与神经损伤组相比，**:p＜0.01；与脂肪干细胞组比较，#:p＜0.01)；
30.图9示出了本发明实施例的一种微球治疗后各组大鼠病理学检测图；其中，图9a为masson三色染色中假手术组(sham)、神经损伤组(bcni)、脂肪干细胞组(t1)、脂肪干细胞微球组(t2)阴茎海绵体平滑肌/胶原比值结果，标尺＝500μm；图9b为不同组别平滑肌/胶原组织比值的统计数据分析，每个条带均表示图9c为免疫荧光染色中假手术组(sham)、神经损伤组(bcni)、脂肪干细胞组(t1)、脂肪干细胞微球组(t2)大鼠阴茎平滑肌/海绵体组织染色结果，上面为平滑肌细胞，中间为同部位的细胞核染色，下面为其对应的的合成图片，标尺＝100μm；图9d为不同组别大鼠阴茎平滑肌/海绵体组织染色统计情况(n＝6)，每个条带均表示图9e为免疫组化染色中假手术组(sham)、神经损伤组(bcni)、脂肪干细胞组(t1)、脂肪干细胞微球组(t2)大鼠阴茎平滑肌/海绵体组织染色结果，标尺＝100μm；图9f为不同组别平滑肌/海绵体比值的统计数据分析图，每个条带均表示(与神经损伤组相比，**：p＜0.01，*：p＜0.05；与脂肪干细胞组相比，#：p＜0.01，&：p＜0.05)。
具体实施方式
31.为更好地理解本发明，将给出具体实施例对本发明做出进一步说明，然而应当理解，所阐述实施例为示例性实施例，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
32.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
33.在本发明的实施例中，若未特别指明，所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中的试剂和材料为市场或其他公共渠道获得。
34.试剂：dmem-bsaic基础培养基(武汉普诺赛公司)；胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗、0.25％胰蛋白酶消化液(以色列biological industries公司)；磷酸盐缓冲液(pbs，美国gibco公司)；masson三色染色液(北京solarbio公司)；α-平滑肌肌动蛋白(α-sma，兔多克隆igg抗体)、alexa fluor-594羊抗兔荧光二抗(美国abcam公司)；hoechst 33342(北京solarbio公司)；防荧光淬灭封片剂(北京碧云天公司)；sp免疫组化试剂盒、浓缩型dab试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；4％多聚甲醛固定液(武汉塞维尔生物科技有限公
司)。
35.仪器：mp150多导电生理仪(美国biopac公司)；生物安全柜、细胞培养箱(美国thermo公司)；激光共聚焦显微镜(日本nikon公司)；普通pcr仪(美国bio-rad公司)；荧光定量pcr仪(美国applied biosystem公司)。
36.生物体：参考文献的方法，从大鼠附睾旁脂肪组织中分离出脂肪间充质干细胞(rat adipose-derived stem cells，radscs)。radscs在含有10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)及1％青霉素-链霉素双抗(pen-strep solution)的dmem-bsaic基础培养基中培养。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，huvec)在含有10％fbs及1％双抗的dmem-basic高糖培养基中，置于37℃、5％ co2培养箱中培养。
37.本发明提供一种间充质干细胞微球无支架的三维规模化的培养方法，包括：
38.s1、细胞培养，将间充质干细胞放入含培养液的培养皿中，将培养皿放入37℃、5％co2的培养箱中培养，当培养皿中的细胞密度达到80-90％时进行传代，消化离心重悬后，得到用于三维细胞培养的细胞悬浮液；
39.s2、三维细胞培养准备，将s1中得到的细胞悬浮液计数，并调节细胞终浓度为2.0
×
10
4-1.2
×
105/ml；
40.s3、三维细胞培养，将细胞悬液移至低贴壁细胞培养皿中，将其放置于具有倾斜角的可变速三维旋转摇床，调节摇床转速为8rpm-16rpm，放置于培养箱中培养，培养后得到三维干细胞微球。
41.实施例1
42.本发明提出了一种多隔室同步旋转生物反应器。
43.参见图3，本发明制备了一种多隔室同步旋转生物反应器，所述反应器下方为固定倾斜角机械三维旋转摇床，倾斜角7
°
，上方为可承载培养皿的平行同步隔室，如图3展示了摇床旋转时候的正面观四种不同的形态，摇床外侧设置有保护罩；参见图4，本发明所述培养皿为动态培养细胞微球所用低贴壁细胞培养皿，可为商业化的低贴壁培养皿、玻璃培养皿或者使用琼脂糖等表面包被的常规培养皿，该培养皿为直径35mm-150mm的不同类型细胞培养皿，该皿特点是低粘附性；该旋转摇床可调控速度为7.0rpm-30.0rpm，通过调整细胞悬液密度和转速可以形成大小较为均一的干细胞微球。
44.结果：多个隔室的设计不仅规模化程度高，大大可以提高工作效率，减少培养时摸索最优条件的时间，而且显著提高msc旁分泌功能；保护罩的设计减少外界环境对微球形成的干扰；动态培养细胞微球所用低贴壁细胞培养皿保证msc在摇床动态培养时不会贴壁，且所述动态培养细胞微球所用低贴壁细胞培养皿为普通细菌培养皿，容易获得；所述反应器下方为固定倾斜角机械三维旋转摇床，由于具有固定倾斜角，三维旋转摇床可使脂肪干细胞减少因自身重力而出现的贴壁现象、使细胞与随时间形成的细胞微球保持持续被动运动状态，依靠摇床给予的离心力以及细胞间粘附力形成微球；进一步地，比较从没有倾斜角到15
°
倾斜角，7
°
～15
°
倾斜角为较适宜脂肪干细胞培养的倾斜角条件，角度大培养基不稳定，容易晃动；角度小搅拌作用差，不能使细胞与培养基充分接触；设置可承载培养皿的平行同步隔室可实现简单、方便、经济、规模化培养间充质干细胞，并进一步提高工作效率；此反应器可以批量化生产条件培养基，用于相关因子的富集和其他多种生物制剂的制备。
45.实施例2
46.本发明提出了一种不同细胞成球方法数据比较实验。
47.通过使用本发明所述多隔室同步旋转生物反应器，比较不同细胞成球方法在上样时间、msc微球产量、培养液获取及细胞旁分泌的区别和效果。
48.结果：见表1，本发明上样时间较短，msc微球产量较以往方法显著提升，培养液获取量也达到了指数级增长，同时，在显著提高细胞旁分泌同时该发明可获得更多的细胞微球及条件培养基；采用本发明中的预测模型预测结果与实测值相差不大，能够较好预测活度值，采用该预测模型能够减少同样实验中参数的确定实验，减少重复性劳动，提高培养效率。
49.表1.不同细胞成球方法数据比较列表
50.不同方法上样时间msc微球产量培养液获取细胞旁分泌悬滴2-3min20-40～1ml显著上调悬滴板1-2min96～3-4ml显著上调微阵列板0.5-1min96040-50ml显著上调本发明0.5-1min2000～300010ml
×
n显著上调
51.实施例3
52.本发明提出了一种脂肪干细胞在三维旋转摇床不同转速下的成球情况实验。
53.利用本发明所述三维旋转摇床，所述为三维摇床培养脂肪来源间充质干细胞(培养基为含5％-15％的胎牛血清的dmem培养基，实验中最佳浓度为含10％胎牛血清培养基，该浓度为细胞培养常用浓度)，该摇床可选择转速范围为7rpm-30rpm，实验中分别选择转速为8rpm、12rpm、16rpm、20rpm转速，结果表明速度过低或过高均不利于微球形成，故实验种最佳速度为12rpm。细胞浓度实验可选用浓度为0.2
×
105/ml-1.2
×
105/ml，浓度过低成球少，浓度过高细胞微球之间亦会相互聚集形成超级微球，不利于后续利用，本实验中最佳浓度为1
×
105/ml，获得细胞微球多，且旁分泌显著。培养时间为48h，观测培养后的细胞成球情况；根据不同的密度制备不同大小的微球，同时利用多隔室同步旋转生物反应器批量获得条件培养基。
54.结果：参见图5a-图5d，脂肪干细胞在三维旋转摇床不同转速下均能很好成球，在48h时成球已较好；参见图1a悬滴模式图及图1b悬滴实际图，普通悬滴操作时间长，反转培养皿盖技术要求高，获得微球损耗多，而与普通悬滴相比较，本发明操作时间短，仅需细胞培养技术即可，获得微球损耗少。参见图2，该种细胞微球培养法需消耗大量耗材，成本高，成球数量少，本发明更快捷/方便。图5为50
×
下拍摄。
55.实施例4
56.本发明提出了一种三维摇床培养脂肪msc微球与2d培养msc的细胞因子基因表达比较实验。
57.获取细胞微球后采用trizol法提取细胞rna并测定rna浓度，用反转录试剂盒(全式金)反转总rna并经pcr仪反转录(55℃5min，85℃5s，-20℃冰箱保存)；采用sybr green荧光染料法(genstar)进行检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)、胎盘生长因子(placenta growth factor，plgf)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，bdnf)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，gdnf)、
神经生长因子(nerve growth factor)，每个样品3个复孔，使用q-pcr仪得到溶解曲线，以β-actin为内参，计算mrna相对含量。不同基因核苷酸引物序列如表2所示，核苷酸序列编号顺序为seq id no:1～seq id no:14。
58.表2.不同基因核苷酸引物序列表
[0059][0060][0061]
结果：由图5、图6a和图6b可以看出，培养过程的细胞接种浓度、培养时间和转速最佳条件分别为1.0
×
105/ml，48h和12rpm。
[0062]
实施例5
[0063]
本发明提出了一种条件培养基用于划痕实验huvec。
[0064]
条件培养基用于划痕实验huvec分别选择huvec培养基、50％huvec培养基+50％adsc 2d培养48h条件培养基、50％ huvec培养基+50％adsc 1
×
105/ml摇床培养48h条件培养基，分析比较选择不同培养基的区别。
[0065]
结果：参见图7a～图7d，在50％huvec培养基+50％adsc 1
×
105/ml条件培养基中摇床培养48h效果最佳；该方法进行细胞三维培养，可显著减少三维培养操作时间，降低时间成本，且无需特殊培养皿，降低制作成本，并可使细胞三维培养规模化，提高收率。
[0066]
实施例6
[0067]
本发明提出了一种制备的微球用于sd大鼠神经性勃起功能障碍(ed)的测定。
[0068]
将三维培养规模化的微球，用于神经性勃起功能障碍的大鼠中进行验证。在经过28天的治疗后，对各组大鼠进行勃起功能检测。大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉。准备2个24g穿刺针，内充满250iu/ml肝素，一端通过pe-50管与多导电生理仪(mp150)连接；游离右侧颈总动脉，插入一根穿刺针，监测大鼠平均动脉压(mean arterial pressure，map)；切开阴茎处皮肤，充分暴露大鼠阴茎海绵体，将另一穿刺针插入阴茎海绵体窦内；开腹并找到位于前列腺后外侧海绵体神经，通过电刺激海绵体神经诱发阴茎勃起。刺激参数为：5v，1.5ma，20hz，脉冲宽度1ms，持续时间60s，记录海绵体内压力(intracavernous presure，icp)的最大值和map，通过比较各组icpmax/map来评估大鼠阴茎勃起功能。
[0069]
结果：参见图8a和图8b，与单纯脂肪干细胞治疗组(t1)相比，脂肪干细胞微球治疗组(t2)具有更好的治疗效果。
[0070]
实施例7
[0071]
本发明提出了一种间充质干细胞微球治疗后各组大鼠病理学检测实验。
[0072]
对各组大鼠进行病理组织学分析。对于masson染色，取大鼠阴茎中段组织，用4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，以5μm的厚度切片；按照masson三色染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片；图像由光学显微镜观察并采集，image j对图像进行分析处理。对于免疫荧光染色，4％多聚甲醛固定后的大鼠阴茎组织10％、20％、30％的蔗糖溶液脱水各12h；oct包埋后冰冻切片(5μm)；室温放置30min，pbs润洗3次，每次5min；0.3％ triton打孔15min，pbs润洗2次，每次5min，使用5％ bsa封闭1h；4℃过夜孵育一抗α-sma(1：300)；pbs润洗2次，每次5min，避光孵育荧光标记二抗(均为1∶500)1h，pbs润洗2次，每次5min；hoechst33342(1:5000)染核10min；pbs润洗2次，每次5min；防荧光淬灭封片剂封片，室温干燥后于激光共聚焦显微镜下拍照并采集图像。对于免疫组化染色，在阴茎中段组织石蜡切片，65℃烤片60min，脱蜡后按说明书应用免疫组化sp法进行检测，玻片晾干后于光学显微镜采集图像，利用平滑肌/海绵体比值评估阴茎平滑肌分布情况。
[0073]
结果：参见图9a～图9f，与单纯脂肪干细胞治疗组(t1)相比，脂肪干细胞微球治疗组(t2)对大鼠海绵体平滑肌含量的表达水平更为显著。
[0074]
以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。