一种阿尔茨海默病模型的建立方法和使用用途与流程

本发明属于疾病模型，具体是一种阿尔茨海默病模型的建立方法和使用用途。

背景技术：

1、阿尔茨海默病(ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，患者大脑随着病程的发展出现一定的脑萎缩情况，并且随着年龄的增长而隐藏恶化。临床表现为一系列精神和认知障碍，包括记忆力下降、行为改变，影响人们的正常生活能。

2、阿尔茨海默症的病理性特征包括：细胞外的由β-淀粉样蛋白(β-amyloid,aβ)聚积成的淀粉样斑块(amyloidplaques)和细胞内的主要由异常过度磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结(neurofibrillarytangle,nft)；aβ分泌到胞外形成淀粉样蛋白斑块；2.tau蛋白过度磷酸化导致神经元之间相互黏连，阻碍神经传导，进而导致记忆衰，因此需要建立阿尔茨海默病模型以研究阿尔茨海默病的发病机制。

3、例如中国专利，公布号为cn114672462a的专利公开了阿尔茨海默病模型及其建立方法和用途，该方法包括以下步骤：细胞重编程：获取具有clu位点突变的ad患者外周血样本，分离得到单核细胞；并将上述单核细胞扩增培养，加入oct3/4、sox2、klf4、c-myc和仙台病毒进行转染，培养得到人源性诱导型神经前体细胞；细胞分化：挑选上述人源性诱导型神经前体细胞克隆，加入pdl和laminin进行扩增培养，培养预定时间后，使上述人源性诱导型神经前体细胞向γ-氨基丁酸能神经前体细胞分化，进行分化培养，得到阿尔茨海默病的mge细胞，即为阿尔茨海默病细胞模型。

4、该专利通过建立clu位点突变的人源化ad小鼠模型，利用ad特异性的hinpc，反映出神经系统疾病的发病机制，但是阿尔茨海默病的发病过程较长，该方法得到的阿尔茨海默病模型不够稳定，无法为长时间研究提供有力支撑，因此，我们提出了一种阿尔茨海默病模型的建立方法和使用用途。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中建立的阿尔茨海默病模型不够稳定，无法为长时间研究提供有力支撑的问题，本发明的目的是提供一种阿尔茨海默病模型的建立方法和使用用途。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种阿尔茨海默病模型的建立方法，包括如下步骤：

3、s1、构建重组载体：获取ad病人脑中提取的病理性aβ，将病理性aβ的编码基因连接到pcmv-ha载体的多克隆位点上，得到重组载体；

4、s2、构建慢病毒载体：重组载体与pmdlg/prre载体、prsv-rev载体共同转染293t细胞得到慢病毒载体；

5、s3、构建阿尔茨海默病细胞模型：以慢病毒载体感染宿主细胞，宿主细胞经扩增培养后，加入硫黄素t培养液进行分化培养，培养完成后注入实验小鼠的海马部分，得到阿尔茨海默病模型。

6、进一步，所述s1中采用粘性末端法将病理性aβ的编码基因连接到pcmv-ha载体的多克隆位点。

7、进一步，所述s2中重组载体的浓度为1.2×105～2×105ciu/ml，pmdlg/prre载体的浓度为1.5×105～2×105ciu/ml，prsv-rev载体的浓度为1.2×105～2×105ciu/ml。

8、进一步，所述s3中宿主细胞选自cho-k1细胞、nih-3h3细胞、人源细胞hff或间充质干细胞。

9、进一步，所述s3中宿主细胞扩增培养采用宿主细胞与pdl细胞激活液按1:1的比例进行扩增培养。

10、进一步，pdl细胞激活液的浓度为0.05-0.1mg/ml。

11、进一步，所述s3中硫黄素t培养液浓度为0.05-0.1mg/ml，分化培养12-20天。

12、进一步，一种阿尔茨海默病模型的使用用途，根据上述建立方法建立的阿尔茨海默病模型用于探索阿尔茨海默病的发病机制和药物筛选。

13、采用上述方案后实现了以下有益效果：

14、1.相比较现有技术，本方案利用重组载体与pmdlg/prre载体、prsv-rev载体共同转染293t细胞，得到携带病理性aβ基因的慢病毒载体稳定性更好，以慢病毒载体感染宿主细胞后注入实验小鼠体内，利用慢病毒的潜伏期和发病期长，保证构建的阿尔茨海默病模型具备长久性和稳定性，为长时间研究提供有力支撑；

15、2.本方案利用低浓度的硫黄素t培养液可以更快的促进aβ聚集，缩短构建阿尔茨海默病模型的时间，进而可以提高探索阿尔茨海默病的发病机制和药物筛选的效率。

技术特征：

1.一种阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：所述s1中采用粘性末端法将病理性aβ的编码基因连接到pcmv-ha载体的多克隆位点。

3.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：所述s2中重组载体的浓度为1.2×105～2×105ciu/ml，pmdlg/prre载体的浓度为1.5×105～2×105ciu/ml，prsv-rev载体的浓度为1.2×105～2×105ciu/ml。

4.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：所述s3中宿主细胞选自cho-k1细胞、nih-3h3细胞、人源细胞hff或间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：所述s3中宿主细胞扩增培养采用宿主细胞与pdl细胞激活液按1:1的比例进行扩增培养。

6.根据权利要求5所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：pdl细胞激活液的浓度为0.05-0.1mg/ml。

7.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病模型的建立方法，其特征在于：所述s3中硫黄素t培养液浓度为0.05-0.1mg/ml，分化培养12-20天。

8.一种阿尔茨海默病模型的使用用途，其特征在于：根据权利要求1-7建立的阿尔茨海默病模型用于探索阿尔茨海默病的发病机制和药物筛选。

技术总结
本发明公开了一种阿尔茨海默病模型的建立方法和使用用途，其建立方法包括：构建重组载体：获取AD病人脑中提取的病理性Aβ，将病理性Aβ的编码基因连接到pCMV‑HA载体的多克隆位点上，得到重组载体；构建慢病毒载体：重组载体与pMDLg/pRRE载体、pRSV‑Rev载体共同转染293T细胞得到慢病毒载体；构建阿尔茨海默病细胞模型：以慢病毒载体感染宿主细胞，宿主细胞经扩增培养后，加入硫黄素T培养液进行分化培养得到阿尔茨海默病细胞模型。

技术研发人员：孙凯,张振,谢佳楠,周珊珊
受保护的技术使用者：深圳市龙岗区第三人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12