tRNA源性小片段RNA及其在胎儿先天性心脏病诊断中的应用

trna源性小片段rna及其在胎儿先天性心脏病诊断中的应用
技术领域
1.本发明属于trna源性小片段rna领域，特别涉及一种小片段rna(trf-58:74-gly-gcc-1)，用于血清中检测该小片段rna诊断试剂盒及制作方法。


背景技术：

2.先天性心脏病(congenital heart disease,简称先心病)定义为出生前和/或出生时出现的心脏或大血管的一般结构异常，是新生儿中最常见的先天性疾病，也是因出生缺陷导致婴儿死亡的最常见原因。不同国家和地区报告的先心病出生人数差异很大，普遍接受的最佳估计是每1,000活产6-13例，死亡率约占产前死亡的40％，出生后第一年死亡的20％。尽管随着产前产后诊断和手术治疗的显著进步，如四维超声、胎儿心脏超声、心脏mri、体外循环技术等，先心病的发病率和死亡率已经大大降低。然而，由于医疗系统环境、筛查人员技能和可用资源的差异，先心病相关的检查程序往往繁琐、低效，因此容易出现诊断上的误诊或漏诊。此外，使用重复超声检查和应用诊断性成像对胎儿损伤的潜在风险仍然存在争议。因此，寻找先心病发病的分子标志物，并开发成胎儿先天性心脏病的诊断试剂盒，对于在孕期通过液态活检即可精准地诊断胎儿先心病，对于患者无疑具有重要的临床意义和社会应用价值
3.近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，遗传物质的表达及调控正在不断被阐述。已有研究表明trna来源的小片段rna(trfs)可调控基因表达，与疾病的发生发展有着密切关系。更为耀眼的是，近两年随着新冠核酸检测试剂盒及ctdna检测在临床上的广泛应用，与传统的蛋白或代谢物检测相比较，核酸检测(包括dna和rna)在疾病诊断中已经体现出尤为卓越的优势：组织特异性强、灵敏度高、检测方法成熟简便、假阳性率低、可重复性强、普及率高等特点。
4.大量研究证实，血液中存在大量的核酸片段，包括双链游离cfdna、小非编码rna(small non-coding rna，sncrna)、trna来源的小片段rna(trfs)等，有可能为疾病诊断和预后提供新的生物标志物，并已开展数项临床研究进一步论证核酸片段在各种疾病诊断中的应用价值。相关研究表明，trfs在多种疾病及肿瘤组织/体液中具有显著差异表达、高稳定性的特征，提示极有可能成为疾病诊断的新指标。但是目前为止，有关trfs与胎儿先心病诊断的相关研究鲜有报道。由于新冠疫情，核酸检测设备和使用已非常成熟，在各地级二甲及以上医院或第三方检测机构均可开展基于核酸检测技术的检验项目。因此，我们希望借此机会能够将核酸检测技术用于此类疾病的孕期诊断，这无疑对提升人口质量、减缓社会负担、增加社会效益、发展地区经济具有重要的帮助。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供trna源性小片段rna(trf-58:74-gly-gcc-1)，在制备胎儿先天性心脏病诊断靶点上的应用，为临床诊断胎儿先天性心脏病提供参考。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种胎儿先天性心脏病分子标志
物trna源性小片段rna，小片段rna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.胎儿先天性心脏病分子标志物trna源性小片段rna在制备胎儿先天性心脏病诊断试剂盒中的应用，所述小片段rna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
8.检测上述一种胎儿先天性心脏病分子标志物trna源性小片段rna表达水平的试剂在制备胎儿先天性心脏病诊断试剂中的应用。
9.进一步的，诊断试剂通过检测被试者血清中小片段rna的表达，与健康对照组相比较特异性升高，以此来判断被试者的胎儿患先天性心脏病的风险。
10.一种用于胎儿先天性心脏病诊断的试剂盒，包含检测血清中小片段rna表达水平的检测试剂，所述小片段rna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
11.进一步的，检测试剂包括：逆转录试剂、pcr反应试剂和引物组。
12.进一步的，引物组包括：
13.(1)rt引物，核苷酸序列如seq id no：2所示；
14.(2)正向引物，核苷酸序列如seq id no：3所示；
15.(3)反向引物，核苷酸序列如seq id no：4所示。
16.本发明的trna源性小片段rna来源于孕妇的外周血。在前期研究中，分离提取胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清中的小片段rna并进行去修饰预处理后，通过高通量测序技术发现：
17.①
胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清(疾病组vs健康组，各6例)的trna源性小片段rna表达谱存在明显差异。
18.②
通过qrt-pcr实验验证发现，trf-58:74-gly-gcc-1在疾病组孕妇血液中的表达水平与健康组孕妇相比显著高表达(疾病组：35例vs健康组：48例)，与高通量测序结果高度一致。
19.因此我们有充分的理由相信：trf-58:74-gly-gcc-1极有可能是胎儿先天性心脏病的分子标志物。
20.基于本发明所述的新用途：可基于trf-58:74-gly-gcc-1为靶点，制备诊断胎儿先天性心脏病的试剂盒。
21.有益效果：trf-58:74-gly-gcc-1不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且稳定性高、显著提高诊断的准确率，提示trf-58:74-gly-gcc-1极有可能成为胎儿先天性心脏病诊断划时代的新指标，trf-58:74-gly-gcc-1的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。
附图说明
22.图1是实施例差异性trfs在胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清标本中验证结果。
23.图2是实施例验证trf-58:74-gly-gcc-1在胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清中表达情况。
24.图3是实施例验证trf-58:74-gly-gcc-1在胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清中表达情况。
25.图4是实施例trf-58:74-gly-gcc-1的受试者工作特征(roc)曲线。
具体实施方式
26.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围。
27.需要说明的是，本技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
28.实施例1
29.收集的临床样本主要来源于胎儿先天性心脏病产前筛查(表2)。分别收集胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清样本各6例。
30.采用高通量测序技术筛选6对胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血清/胎儿心脏正常的孕妇外周血清中的差异trfs(log2fc》1.5，p《0.05)。结果发现：相对于胎儿心脏健康组，胎儿先天性心脏病组中差异高表达的trfs有28条，低表达的有36条(表3)。
31.实施例2
32.定量pcr检测：
33.步骤1：收集孕妇血清样本；步骤2：使用trizol试剂提取孕妇血清总rna；步骤3：通过rna逆转录反应得到cdna，逆转录试剂为rtstar
tm
trf&tirna预处理试剂盒(arraystar,usa)；步骤4：用特异性trfs核糖核酸设计引物(rt引物，核苷酸序列如seq id no：2所示；正向引物，核苷酸序列如seq id no：3所示；反向引物，核苷酸序列如seq id no：4所示)向pcr体系中加入荧光染料sybr green利用荧光定量pcr仪进行定量pcr反应，pcr反应试剂为针对为表1所示序列设计的bulger-loop mirna qrt-pcr stater kit(ribobio,china)试剂盒。步骤3中的逆转录的反应体系包括2μl 5x rt buffer、2μl rtase mix、1μl rt primer以及1μl rna模板，4μl rnase-free h2o，反应步骤为42℃孵育60分钟,70℃孵育10分钟，4℃保存。步骤4的pcr体系包括1μl cdna、3.2μl rnase-free h2o,0.4μlbulge-loop
tm mirna forward primer,0.4μl bulge-loop
tm reverse primer,5μl 2x sybr green mixture(5μl)，反应条件为95℃10分钟，95℃2秒，60℃20秒，70℃20秒进行40个循环，接着95℃15秒，60℃1分钟。
34.针对测序结果，挑选组间差异倍数大于1.5倍、组内差异倍数较小的18条trfs(与胎儿心脏健康组相比，胎儿先天性心脏病组中5条表达升高、13条表达降低)在临床样本中验证这它们的表达规律。在胎儿先天性心脏病组、胎儿心脏健康组样本中(12例vs 12例)，定量pcr结果显示：与胎儿心脏健康组相比，1条trfs在胎儿先天性心脏病组样本中表达上调，1条trfs表达下调，与测序结果基本一致(图1)。为进一步评价这些差异表达的trfs与先天性心脏病的相关性，我们在胎儿先天性心脏病组、胎儿心脏健康组样本中(35例vs 48例)血液样本中，采用real-time pcr再次验证这2条trfs的表达水平，结果显示其中仅一条trfs(trf-58:74-gly-gcc-1)呈现出在胎儿先天性心脏病组血液中较胎儿心脏健康组血液中显著高表达，与测序结果基本一致(图2)。在各种类型的先天性心脏病中我们发现，在胎
儿被诊断为室间隔缺损的血液样本中，trf-58:74-gly-gcc-1的表达量较胎儿心脏健康组血液中的表达量显著增高(图3)。然而，这一点在被诊断为其他类型的胎儿先天性心脏病中未发现差异表达。
35.实施例3
36.对trf-58:74-gly-gcc-1的表达水平进行排序，显示患者的状态(1为先心病，0为健康)。通过使用二项精确置信区间计算曲线下面积(auc),生成roc曲线。auc＝0.7720(p《0.0001,95％ ci＝0.6703-0.8738),提示在trf-58:74-gly-gcc-1在胎儿先天性心脏病中具有良好的诊断价值(图4)。
37.结论：trf-58:74-gly-gcc-1可稳定且特异性表达于胎儿被诊断为先天性心脏病的孕妇外周血中，可能为胎儿先天性心脏病的诊断提供新的思路和有效的检测方法。
38.表1.trf-58:74-gly-gcc-1的核酸序列
[0039][0040]
表2.临床样本基本信息
[0041][0042]
两组患者的年龄指数无统计学差异(p》0.05)
[0043]
表3.差异性表达的trfs(log2fc》1.5，p《0.05)
[0044]
[0045][0046]
应理解，本发明仅以举例方式加以描述并可同时在本发明的范围和精神内进行修改。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。