重组SLO抗原的制备方法和应用与流程

重组slo抗原的制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，特别涉及重组slo抗原的制备方法和应用。


背景技术：

2.链球菌溶血素o(streptolysin-o或简称slo)是a族链球菌毒素的分泌毒力因子，属于硫醇活化毒素组。其分子量为63.64kda，是由571个氨基酸组成。一般来说，a族链球菌感染患者在感染后2周左右即可检出slo抗体。并且随着感染时间加长，slo抗体含量逐渐升高，于感染后第4周到达顶峰。其中以活动性风湿热和急性肾小球肾炎为例，感染后slo抗体有明显升高，其效价能达到1：400。因此slo抗体的含量逐渐升高对于临床诊断有重要意义。从天然的溶血链球菌菌株中提取slo蛋白存在产量低、操作风险大、不易于工业化生产等缺点。应用重组蛋白法制备slo抗原虽然解决了天然纯化中来源短缺的问题，但所得产物产量低、稳定性不好、活性低。
3.因此，本领域尚需开发产量高、稳定性好，活性高的重组slo抗原的制备方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种重组slo抗原制备方法。
5.本发明的另一目的在于提供一种编码slo抗原的多核苷酸序列。
6.本发明的另一目的在于提供与编码slo抗原的多核苷酸序列适配的载体。
7.本发明的另一目的在于提供含有编码slo抗原的多核苷酸序列的试剂盒。
8.为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码slo抗原的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
9.(i)具有如seq id no.2所示序列的多核苷酸；
10.(ii)具有与如seq id no.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
11.(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
12.本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。
13.在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pet-28a(+)。
14.本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者
15.所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。
16.在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。
17.在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌rosetta(de3)菌株。
18.本发明第四方面提供了一种制备slo抗原的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
19.分离所述目的蛋白，即得所述slo抗原；
20.其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如seq id no:1所示的氨基酸序列。
21.在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第一方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
22.在一些优选的方案中，用sb、tb或soc培养基培养所述的宿主细胞。为获得大量可溶性表达，在更优选的方案中，用tb培养基培养所述的宿主细胞。
23.在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。
24.在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞；或在温度为36至38℃下培养所述宿主细胞。
25.在一些更优选的方案中，在温度为16至19℃下，用tb培养基培养所述宿主细胞，可获得更高的可溶性目的蛋白表达。
26.在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
27.在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。
28.在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至od600在0.6至0.8，后使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。
29.在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：
30.将经破碎的目的蛋白上清液通过层析柱，进行洗脱，收集洗脱液。
31.在一些优选的方案中，所述层析柱为ni-柱亲和层析柱。
32.本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者
33.如本发明第二方面提供的表达载体；或者
34.如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者
35.或者根据本发明第四方面所述的方法制备的slo抗原。
36.本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
37.(1)本发明开发了基于基因工程技术的slo抗原制备方法，将经同义密码子偏好性优化的编码slo抗原的多核苷酸导入载体，成功构建原核表达质粒，提高了目的蛋白的表达量；
38.(2)本发明开发了基于基因工程技术的slo抗原制备方法，经过培养基和培养温度等培养条件的优化，实现了高比例可溶性蛋白的表达，所得抗原活性高；
39.(4)本发明优选的实施方式中提供的slo抗原制备方法制备的slo抗原，在化学发光检测中能获得大于r值大于0.99的标准曲线，线性良好。
40.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
41.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
42.图1是根据本发明实施例中制备的slo抗原的sds-page鉴定结果图；
43.图2是根据本发明实施例中18℃诱导表达slo抗原电泳图。
44.图3是根据本发明实施例中25℃诱导表达slo抗原电泳图。
具体实施方式
45.本发明人经过广泛而深入的研究，开发了基于原核表达系统的slo抗原表达体系，并进一步通过同义密码子偏好性优化，得到了能够在大肠杆菌表达系统中大量表达目的蛋白的编码slo抗原的多核苷酸序列，所表达的目的蛋白活性高，稳定性好。
46.发明人进一步通过对slo抗原表达条件的优化，包括培养基和培养温度的优化，获得了高效可溶性表达slo抗原的方法。在本发明的更优选的实施方式中，在18℃的温度下，用tb培养基培养包含本发明编码slo抗原的多核苷酸的宿主细胞。
47.获取目的基因/获取目的蛋白有关的核酸序列
48.本发明中目的蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
49.一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
50.此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
51.应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的基因。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
52.在本发明的一个实施方式中，通过ncbi数据库对目的蛋白的氨基酸序列(seq id no:2)进行分析，获得目的基因序列信息。例如通过ncbi数据库对球形节杆菌slo抗原的氨基酸序列进行分析，获得编码其的目的基因序列。
53.同义密码子偏好性优化
54.为克服在大肠杆菌中表达异源蛋白时产量降低的潜在问题，本发明涉及经同义密码子偏好性优化的多核苷酸序列。对获取的目的基因序列进行同义密码子偏好性优化，经同义密码子偏好性优化的目的基因序列(seq id no:2)可表达与目的蛋白相同的氨基酸序列，但表达过程稳定性和效率得以提升，最终所得目的蛋白维持了较高的活性。
55.本发明还涉及与seq id no:2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和与seq id no:2所示序列互补的多核苷酸。
56.目的基因的载体
57.本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。本发明中“载体”表示线性或环状dna分子，其包含编码目的蛋白的片段，所述目的蛋白可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒dna，或可以是合成的。载体可以是合成的或方便地进行重
组dna操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。本发明的一个实施例中选择pet-28a(+)作为载体，以获取更高效的表达效率。
58.本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。示例性地，使用dna内切酶将载体dna分子切割成可与外源基因连接的线性分子，然后将经密码子优化的目的基因片段连接于载体，可选用单酶切位点的黏端连接、双酶切片段的定向克隆、不同限制酶切位点的黏端连接、平端连接、人工接头连接或同寡核苷酸末端连接实现外源dna片段的插入。
59.含有目的基因的载体转化宿主细胞
60.本发明还涉及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。含有经密码子优化的目的基因的载体可以通过已知的方法插入、转染或乙其他方式转化到宿主细胞中，从而获得含有本发明经密码子优化的目的基因并能够表达目的蛋白的转化体。本发明中“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞，宿主细胞优选是细菌，并且优选是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌rosetta(de3)菌种(escherichia coli rosetta(de3)strain)。
61.制备目的蛋白的方法
62.本发明还涉及制备目的蛋白的方法，可利用本发明的多核苷酸序列表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
63.(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
64.(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
65.(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
66.其中，步骤(1)含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。
67.获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，优选为sb、tb或soc培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。为促进目的蛋白的表达并提升可溶蛋白的表达量，本发明的一个优选的实施方式，使用tb培养基培养的宿主细胞，且所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
68.为进一步促进目的蛋白的可溶性表达，在本发明的一个优选的实施方式中，培养宿主细胞至od
600
在0.6-0.8之间后，采用iptg进行诱导，并在17至19℃下继续培养约8至12小时。
69.在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果
需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在本发明的一个实施方式中，使用亲和层析法分子目的蛋白。
70.在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞(例如，
“”
)只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。
71.如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。
72.本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。
73.如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽。在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在(如果有的话)通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
74.如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
75.本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
76.如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。
77.如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来
计算。
78.如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是actgaac，则其反向互补序列是gttcat。
79.如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。
80.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
81.除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本技术的示例性实施方式。
82.实施例1、构建slo质粒并转染宿主细胞
83.(1)获取人slo氨基酸序列seq id no:1，对其进行分析获取基因序列，对基因序列进行同义密码子偏好性优化，得到数个经同义密码子偏好性优化的基因序列。经大肠杆菌同义密码子偏好性优化后，分别连接载体为pet-28a(+)合成重组表达质粒。
84.(2)重组质粒导入宿主大肠杆菌
85.取1μl步骤(1)中制备的表达质粒，在冰浴条件下，加入到30μl大肠杆菌感受态rosetta(de3)中，冰浴放置20min，热激90s，立刻冰上放置2min，加入400μl不含抗生素的soc培养基，37℃、220rpm振荡培养50min。取100μl菌液均匀涂布到含100μg/ml卡那抗性的lb平板上，37℃培养箱培养过夜。
86.seq id no:1
87.msnkktfkkysrvaglltaaliignlvtanaesnkqntastettttseqpkpesseltiekagqkmddmlnsndmiklap
88.kemplesaekeekksedkkkseedhteeindkiyslnynelevlakngetienfvpkegvkkadkfivierkkkninttp
89.vdisiidsvtdrtypaalqlankgftenkpdavvtkrnpqkihidlpgmgdkatvevndptyanvstaidnlvnqwhdny
90.sggntlpartqytesmvysksqieaalnvnskildgtlgidfksiskgekkvmiaaykqifytvsanlpnnpadvfdksv
91.tfkdlqrkgvsneapplfvsnvaygrtvfvkletssksndveaafsaalkgtdvktngkysdilenssftavvlggdaae
92.hnkvvtkdfdvirnvikdnatfsrknpaypisytsvflknnkiagvnnrteyvettsteytsgkinlshqgayvaqyeil
93.wdeinyddkgkevitkrrwdnnwysktspfstviplgansrnirimarectglawewwrkviderdvklskeinvnisgs
94.tlspygsityk
95.部分优化密码子例举如下：
96.优化密码子1(seq id no:2)
97.atgtcaaataaaaaaacatttaaaaagtattctcgtgttgctggcctgttgactgcggctttgatcatcggcaatttggt
98.tactgccaacgcggaatctaacaaacagaataccgctagcacggaaaccacgactacctctgaacagccgaagccggaat
99.ccagcgagctgaccattgagaaagcaggtcaaaaaatggatgatatgctgaacagcaacgacatgatcaaactggcaccg
100.aaagagatgccgctggaaagcgccgagaaggaagagaagaagtcggaggataagaaaaaaagcgaagaagaccacaccga
101.ggagatcaacgacaaaatctactcgctgaattacaatgaactggaagtgttggcgaaaaacggcgaaacgattgagaact
102.ttgtaccgaaagagggtgttaagaaagcggacaagtttattgttatcgagcgcaaaaagaagaacattaacaccactccg
103.gttgatatctccattatcgacagcgttaccgatcgtacgtacccggctgcgctccaactggcaaataaaggttttaccga
104.gaataagccggatgcggtcgtgacgaaacgtaacccacagaaaatccacattgacctgccgggtatgggtgataaggcga
105.ccgtggaagtcaacgatccgacctacgcgaatgtaagcaccgcaattgacaacttagttaaccagtggcatgataactac
106.tctggtggcaacaccctgccggcgcgtacccagtataccgaaagcatggtttattctaaatcgcaaattgaggcggcgct
107.gaatgtgaactccaagattcttgatggtacactgggtattgacttcaaaagcattagcaaaggtgaaaaaaaggtcatga
108.tcgctgcgtacaaacaaatcttttataccgttagcgccaacctcccaaataacccggcggacgtgttcgataagtccgtg
109.accttcaaagacctgcaacgtaagggcgttagcaacgaggcgcctccgttgtttgtttcgaacgttgcatacggcagaac
110.ggtgttcgtgaagctggaaaccagcagcaagtccaacgacgtggaagcggcgtttagcgcagcgcttaagggaaccgatg
111.tgaagaccaatggtaaatattcggatatcttggagaactccagcttcacggcggtggtgctgggtggtgacgccgcggag
112.cacaacaaagttgtcaccaaggacttcgacgtcatccgcaatgtcattaaagacaacgccaccttctctagaaagaaccc
113.ggcgtacccgattagctatacctccgtgttcctgaagaacaacaagatcgcaggcgttaacaaccgtaccgagtatgttg
114.agacgaccagcactgagtacacgagcggcaaaatcaacttaagccatcagggtgcttacgttgctcagtatgaaatcctg
115.tgggatgaaattaattacgatgacaaaggcaaagaggtgatcaccaagcgccgttgggacaataattgg
tatagcaaaac
116.ctcaccgtttagcaccgtaatcccgctgggtgccaactcgcgcaacattcgtattatggcacgtgagtgcaccggtttgg
117.cctgggaatggtggcgtaaagtgattgacgaacgcgacgtgaagctgtccaaggagatcaatgtgaatatctccggctcc
118.acgctgtctccgtatggcagcattacctacaaa
119.优化密码子2(seq id no:3)
120.atgtccaacaagaaaaccttcaaaaaatacagccgtgttgcaggtctgctgactgcagcactgatcatcggtaacctggt
121.taccgctaacgcagaatctaacaaacagaacaccgcgagcactgaaaccactactacttccgaacagccgaaaccggaat
122.cttccgaactgaccatcgaaaaggcaggccagaagatggacgacatgctgaatagcaacgacatgattaaactggcaccg
123.aaagaaatgccactggagtccgctgaaaaagaagaaaaaaaatccgaagataaaaagaaaagcgaagaagatcataccga
124.agaaatcaacgacaaaatttattctctgaactataacgaactggaagttctggcaaagaacggcgagaccatcgaaaact
125.ttgtcccgaaagaaggtgtaaagaaagctgacaaattcatcgttatcgagcgcaaaaaaaaaaatatcaacaccaccccg
126.gtcgatatttctatcatcgactctgttactgaccgtacctacccggcggcactgcagctggcaaacaaaggtttcaccga
127.aaacaaaccggatgcggttgttaccaaacgtaacccgcagaaaattcatatcgacctgccgggcatgggcgataaagcta
128.ccgttgaagtgaacgatcctacctacgcgaacgtttctactgctatcgacaacctggtaaaccagtggcatgacaactat
129.tccggtggtaacacgctgccggcgcgtacccagtacaccgaatccatggtgtactccaaaagccagatcgaagctgcgct
130.gaacgttaatagcaagattctggacggtactctgggtatcgactttaaatccatctccaaaggcgaaaaaaaagttatga
131.ttgcggcttacaaacaaatcttctataccgttagcgcgaacctgccgaataacccggcggacgttttcgacaaaagcgtt
132.acctttaaggacctgcaacgtaaaggtgtatctaacgaagccccaccgctgttcgtatctaacgtggcttacggccgcac
133.tgtgttcgtgaaactggaaacctcttccaagagcaacgatgtcgaagctgcattctctgcagctctgaagggcactgatg
134.tgaagaccaacggtaaatactccgacattctggaaaattcctctttcaccgccgttgtcctgggtggtgacgccgcagaa
135.cacaacaaagttgttactaaagatttcgacgttattcgtaacgttatcaaagacaatgctaccttctcccgcaaaaaccc
136.agcatatccgatctcctacaccagcgtgttcctgaaaaacaacaaaatcgctggcgtcaacaaccgtaccgagtacgtag
137.aaacgacctccaccgaatatacttctggtaaaattaacctgtcccaccagggcgcgtatgtggcacagtacgaaatcctg
138.tgggacgagattaactatgatgataaaggcaaagaagttattactaaacgtcgttgggacaacaattggtactccaagac
139.ctccccgttctctaccgtgatcccactgggtgctaactcccgtaacatccgtattatggctcgtgaatgtaccggtctgg
140.cttgggaatggtggcgtaaagttatcgacgaacgtgacgttaagctgtctaaggagattaatgtcaacatctctggctct
141.accctgtctccgtacggttctattacctataaa
142.优化密码子3(seq id no:4)
143.atgtctaacaaaaaaaccttcaaaaaatactctcgcgtagcaggtctgctgaccgccgcactgatcatcggtaacctggt
144.caccgctaacgctgaatctaataaacagaacacggcttccacggaaaccaccacgacgtctgaacaaccgaaaccggaat
145.ctagcgaactgactatcgaaaaagctggccaaaaaatggatgatatgctgaactccaatgacatgattaaactggctccg
146.aaagaaatgcctctggaatctgcggaaaaagaggaaaaaaaaagcgaagataaaaaaaaaagcgaggaagaccacaccga
147.agaaatcaacgataaaatctattctctgaactacaacgaactggaggttctggctaaaaacggtgagaccattgaaaact
148.tcgtgccgaaagaaggcgtaaaaaaagccgacaaattcatcgttattgaacgtaaaaaaaaaaacatcaacaccaccccg
149.gtggacatctctatcattgactctgtaaccgaccgtacctacccggcagctctgcagctggccaacaagggtttcaccga
150.aaacaaaccggacgctgttgtgaccaaacgcaacccgcagaaaattcacatcgacctgccaggcatgggtgataaggcga
151.ccgtcgaagtgaacgatccaacttacgctaacgtttccaccgcaattgataacctggttaaccagtggcacgacaactac
152.tctggtggtaacaccctgccagcgcgcactcagtacaccgagtctatggtatacagcaaatcccagatcgaggcagcgct
153.gaacgtaaactctaaaatcctggatggtactctgggtatcgatttcaaaagcattagcaaaggtgagaaaaaagtgatga
154.ttgcggcttacaaacagatcttctacaccgtgtctgctaatctgccgaacaacccagctgatgtcttcgacaaatccgta
155.acgttcaaagatctgcaacgtaaaggcgtctctaacgaagctccgccgctgttcgtcagcaacgtagcatacggccgtac
156.cgtgtttgtaaaactggaaacttcctccaaaagcaacgacgttgaggcggctttctctgcagcactgaa
gggtaccgatg
157.ttaaaaccaacggcaaatattctgacatcctggagaactcttccttcactgctgttgtgctgggcggtgatgctgcggaa
158.cacaacaaagtggtgaccaaagacttcgatgtaatccgtaacgtgatcaaagacaacgctactttctctcgtaaaaaccc
159.ggcttatccgatcagctatacgagcgttttcctgaagaacaacaagattgcaggcgttaacaaccgtactgagtacgtag
160.aaaccacttctaccgaatacacctctggtaaaatcaacctgagccaccagggtgcttacgtggcacagtacgaaattctg
161.tgggatgagatcaactatgacgacaaaggcaaagaagtgattaccaaacgccgttgggataataactggtattctaagac
162.ttctccgttcagcactgtgatcccgctgggcgcgaattcccgcaacatccgcatcatggcgcgtgaatgtactggcctgg
163.cgtgggaatggtggcgtaaagttatcgacgaacgcgatgttaaactgtccaaagaaatcaacgtgaatatttccggttct
164.accctgtccccgtacggcagcattacctataaa
165.实施例2、目的基因的表达
166.挑取步骤实施例1中制备的单克隆，无菌操作接种于含100μg/ml卡那抗性的tb培养基中，37℃，220rpm振荡培养至od600在0.6-0.8之间，终浓度0.1mm iptg进行诱导，分别放置于18℃和37℃振荡培养过夜。取等量三种不同培养基的菌液超声破碎进行sds-page鉴定，鉴定结果见图1。
167.如图1所示，1-2列：优化密码子1表达破碎的上清、沉淀；3-4列：优化密码子2表达破碎的上清、沉淀；5-6列：优化密码子3表达破碎的上清、沉淀。结果显示：优化密码子1表达目的蛋白更多比例表达于上清液中，且表达量明显高于其他优化密码子。
168.实施例3、表达产物的纯化
169.选取优化密码子1构建的重组菌株，采用tb培养基，放置于18℃和25℃诱导表达培养，收集并称取菌体，分别加入lysis buffer冰上重悬。超声破碎后4℃，20000rpm离心30min，取上清，0.22um针式过滤器过滤得到过滤后原液。原液过ni-nta层析柱，用50mm tris-hcl，50mm nacl，200mm咪唑ph 7.0洗脱的蛋白即为目的蛋白，洗脱得到蛋白。18℃和25℃表达纯化的电泳图分别如图2、3所示，其中18℃下每升培养基大约可纯化328毫克的目的蛋白，25℃每升培养基大约可纯化150毫克的目的蛋白。说明在tb培养基中，18℃比25℃重组slo蛋白的表达量高。
170.实施例4、化学发光法鉴定目的蛋白活性
171.(1)抗原活性测定
172.采用胶乳免疫比浊法，检测tb培养基18℃和25℃表达重组slo蛋白的抗原活性。将slo和胶乳混合，将两者混匀后静置8小时，之后透析除去未连接上的抗原。加入封闭液，封闭后离心去上清，制成slo抗原的胶乳微球。然后加入含peg的pb缓冲液和slo单抗(abcam)，采用日立7180全自动生化仪，在600nm波长下进行测定，分析方法为两点终点法。
173.结果由表1可知，18℃所表达蛋白最高吸光度为3471，线性回归方程为y＝5.4388x
+37.314，r2＝0.9979(r2＞0.95)，线性相关度很高；25℃蛋白所表达蛋白最高吸光度为665，线性回归方程为:y＝1.0498x+59.371，r2＝0.9283(r2＜0.95)，线性相关度差。由以上结果可知在线性测定范围内，18℃比25℃所表达重组slo蛋白的检测活性和线性相关性都更好。说明本发明中的slo抗原制备方法适宜在温度低于室温的18℃下。
174.表1
[0175][0176]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。