一种多孔膜插件及高通量类器官原位形成的方法和应用

本发明属于器官芯片与类器官技术开发领域，具体涉及一种多孔膜插件及高通量类器官原位形成的方法和应用。

背景技术：

1、类器官是近年来发展起来的一种体外器官模型，主要包括肿瘤类器官和干细胞来源类器官两种形式。前者是通过提取肿瘤原代组织获得肿瘤微球，是原代组织培养技术的延申，技术门槛相对较低。后者是指通过干细胞自组织方式形成细胞微球，进一步在体外三维(3d)培养条件下分化形成的细胞组织复合体[1-3]。干细胞衍生的类器官通常具有人体组织器官的部分关键组织结构和功能特征，已在发育生物学研究、疾病模拟、药物评价和组织修复等领域显示出重要应用前景。但现有类器官培养体系在细胞微球均一性、组织微环境可控性、类器官成熟度以及规模化培养等方面仍面临很多挑战，这在一定程度上也制约其广泛应用。

2、目前，类器官的培养方式主要包括非黏附孔板与微坑芯片两种。非黏附孔板可以在孔板底部通过细胞自组织形成多个细胞微球，操作简单、易上手，但具有形成类器官均一性差、可控性低的局限。微坑芯片可以形成较为均一的细胞微球，但由于微坑内的流体传质效率低，导致营养物质交换不充分。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种多孔膜插件及高通量类器官原位形成的方法和应用，以解决生物学研究中类器官形成过程中尺寸均一性差、培养物质交换不充分等问题。

2、本发明第一方面提供了一种多孔膜插件，包括transwell培养插件，所述transwell培养插件内的底面的结构为多孔膜，所述多孔膜的上表面覆盖有pdms薄膜，所述pdms薄膜上设有模孔阵列，所述模孔阵列内用于生长形成细胞球。

3、本发明第二方面提供了一种高通量类器官原位形成的方法，包括如下步骤：

4、将上述的多孔膜插件浸泡在pf127溶液中，除去所述多孔膜插件内的气泡；

5、用pbs或细胞培养基冲洗所述多孔膜插件数遍，将消化后的细胞悬液接种在所述多孔膜插件内部，形成细胞球。

6、进一步地，所述多孔膜插件浸泡在pf127溶液中的时间为4小时以上。

7、进一步地，所述pdms薄膜具有多孔镂空阵列结构；所述pdms薄膜由软光刻模具法、打孔法或占位法制作形成。

8、进一步地，所述pdms薄膜通过生物相容性的生物胶水封接在所述多孔膜上表面；所述生物胶水选自如pdms胶水或医疗级ab胶。

9、进一步地，所述pf127溶液的质量百分浓度为0.2-2％，其作用是抑制细胞贴壁生长。

10、进一步地，形成细胞球的条件为静置培养或摇动培养。

11、本发明第三方面提供了细胞球在干细胞来源类器官的均一化制备中的应用。

12、本发明提供的优点在于：

13、本发明中所使用的插件为常规商品化transwell培养板的插件，自带的多孔膜11为pet膜或pc膜。具有镂空多孔阵列结构的pdms薄膜3，厚度约500微米，镂空孔的直径为上部450微米，底部350微米的锥型结构。pdms薄膜3上的镂空阵列结构是通过模板挤压法形成的，即将pdms倒在具有微柱阵列结构(微柱直径350-450微米)的模板上，在模板上方放一块平整的胶垫和玻璃片，通过上下表面施压的方式排出小柱上方的pdms，进而固化形成镂空微坑结构。该微孔的直径、深度由模板上小柱的直径、高度决定。pdms薄膜的大小与选用的transwell培养板类型相匹配，可以定制圆口刻刀进行快速切割。

14、本发明培养腔内经过pf127修饰可以抑制细胞贴壁，在细胞悬液接种到插件内后，细胞会沉降在pdms多孔阵列内，形成细胞球。由于每个pdms孔沉入的细胞数量大致相当，且350-450微米的微坑直径有利于促进细胞球的形成，本发明每个微坑内形成单一细胞球的概率较高，且细胞球直径的均一性好。

15、使用本发明方法，后续可以用于干细胞来源类器官的诱导分化。并且本方法pdms微坑的底部是transwell多孔膜，微坑内细胞球/类器官上方和下方都可以进行培养液的交换，相对于传统方法物质交换更充分，有利于细胞球/类器官的培养和功能维持。

16、另外本发明还具有以下优点：

17、1、培养插件制备简单，多孔pdms薄膜与商品化transwell结合，无需专业加工设备；

18、2、操作简单、快速，一步法形成类器官；

19、3、培养体系物质交换充分，利于细胞球/类器官的培养和功能维持。

技术特征：

1.一种多孔膜插件，其特征在于，包括transwell培养插件(1)，所述transwell培养插件(1)内的底面的结构为多孔膜(11)，所述多孔膜(11)的上表面覆盖有pdms薄膜(3)，所述pdms薄膜(3)上设有模孔阵列(31)，所述模孔阵列(31)内用于生长形成细胞球(2)。

2.一种高通量类器官原位形成的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的高通量类器官原位形成的方法，其特征在于，所述多孔膜插件浸泡在pf127溶液中的时间为4小时以上。

4.根据权利要求2所述的高通量类器官原位形成的方法，其特征在于，所述pdms薄膜(3)具有多孔镂空阵列结构；所述pdms薄膜(3)由软光刻模具法、打孔法或占位法制作形成。

5.根据权利要求2所述的高通量类器官原位形成的方法，其特征在于，所述pdms薄膜(3)通过生物相容性的生物胶水封接在所述多孔膜(11)上表面；所述生物胶水选自如pdms胶水或医疗级ab胶。

6.根据权利要求2所述的高通量类器官原位形成的方法，其特征在于，所述pf127溶液的质量百分浓度为0.2-2％。

7.根据权利要求2所述的高通量类器官原位形成的方法，其特征在于，形成细胞球的条件为静置培养或摇动培养。

8.一种权利要求1所述的多孔膜插件培养的细胞球或权利要求2～7任意一项所述的方法制备的细胞球在干细胞来源类器官的均一化制备中的应用。

技术总结
本发明公开了一种多孔膜插件及高通量类器官原位形成的方法和应用，属于器官芯片与类器官技术开发领域。本发明包括transwell培养插件，所述transwell培养插件内的底面的结构为多孔膜，所述多孔膜的上表面覆盖有PDMS薄膜，所述PDMS薄膜上设有模孔阵列，所述模孔阵列内用于生长形成细胞微球。本发明的培养体系物质交换充分，利于细胞球/类器官的培养和功能维持。

技术研发人员：秦建华,张旭
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12