一种高通量筛选细胞运动情况的方法

本发明属于细胞运动筛选领域，特别涉及一种高通量筛选细胞运动情况的方法。

背景技术：

1、细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动被称为细胞迁移，其中，环境中的微小直流电场广泛存在于多细胞生物体内以及环境中，它能够指导细胞发生朝向阳极或阴极的方向发生定向迁移，这种行为也被称为趋电性或向电性。人们对细胞趋电性的研究历史较短，因此，对于细胞如何感受电场及其响应机制都并不清楚。模式生物是细胞生物学研究领域常用的研究手段，这是由于物种间在基因水平上存在保守性，且这些保守的基因及其表达产物间存在功能的相似性，因此，利用模式生物来研究可以为复杂的高等生物研究提供有益的借鉴作用。

2、盘基网柄菌是近年来用于研究细胞趋电性迁移的理想模式生物。野生型的盘基网柄菌在强度为12v/cm的直流电场中表现出明显的朝向电场负极迁移的现象，且前期的研究表明盘基网柄菌细胞在电场中的趋电性受基因水平的调控。例如，piaa、rasg等基因缺失后会抑制细胞的趋电性运动，相反，gefd基因缺失后却增强细胞的趋电性运动。然而现有技术存在两个突出的问题，其一就是效率低，每次实验只能对一种或一个类型的突变株进行趋电性表型研究；其二，本专利申请人在之前报道的名为“编码的载玻片”的高通量筛选技术，该技术效率高，但操作复杂，更适用于哺乳动物细胞突变株的研究。

3、现有的基因水平研究直流电场指导细胞定向迁移机制中，由于一个趋电小室只能种植一种细胞或一种突变株，耗时长，效率低，不适用于筛选一些突变库，例如remi突变库、rnai突变库，以及crispr/cas9编辑技术获得的一系列突变子。在一个趋电小室种植多个细胞则鲜有涉及，其原因是大部分研究者都以哺乳动物细胞为实验材料，然而，哺乳动物的贴壁需要提前用一些胶原蛋白处理，不便于实现小室的区域化处理。针对哺乳动物细胞，可以通过建立编码微玻片方法来解决高通量筛选突变子表型的技术。而编码微玻片高通量筛选技术却不是盘基网柄菌细胞研究的理想方法，因此，如何解决设计一种高效且适用于模式生物盘基网柄菌突变株趋电性筛选方法是需要解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提出了一种高通量筛选细胞运动情况的方法，所述方法包括以下步骤：

2、将无菌培养至指数生长阶段的盘基网柄菌细胞进行饥饿处理；

3、制作包含多个独立的细胞接种区的趋电小室，将饥饿处理后的盘基网柄菌细胞接种到每个独立的细胞接种区中；

4、将接种有盘基网柄菌细胞的趋电小室与缓冲液进行电性连接，利用多点实时录像系统分别聚焦于每个细胞接种区中的盘基网柄菌细胞完成录像；

5、对录像数据进行分析，并根据分析结果完成对盘基网柄菌细胞运动情况的筛选。

6、进一步地，所述盘基网柄菌细胞包括正常的盘基网柄菌细胞和突变株细胞。

7、进一步地，将无菌培养的指数生长阶段的盘基网柄菌细胞进行饥饿处理之前需要对盘基网柄菌细胞进行复苏、传代和传代后培养；

8、将盘基网柄菌细胞进行复苏具体为：从超低温冰箱中取出冻存管，室温使冻存管融化；将冻存管中的细胞悬液转移到含有hl5培养基的培养皿中，放入22℃培养箱中复苏过夜，移去hl5培养基；加入新鲜的hl5培养基，放入22℃培养箱培养，直至盘基网柄菌细胞的浓度到达2～4×106ml-1；

9、将盘基网柄菌细胞的传代具体为：将浓度到达2～4×106ml-1的盘基网柄菌细胞按1:100-1:200的稀释度稀释在新鲜的hl5培养基中进行传代；

10、将盘基网柄菌细胞进行传代后培养具体为：将传代培养中指数生长阶段的盘基网柄菌细胞到含有hl5培养基的24孔板中贴壁4h或过夜培养。

11、进一步地，hl5培养基的配方为：葡萄糖40g，蛋白胨40g，酵母粉20g，na2hpo4·7h2o3.86g，kh2po41.94g，streptomycin 0.12g，ddh2o定容至4l，调节ph为6.5。

12、进一步地，将盘基网柄菌细胞进行饥饿处理为：移除hl5培养基，用新鲜配制的db缓冲液置换hl5培养基，22℃进行饥饿处理3小时。

13、进一步地，制作包含多个独立的细胞接种区的趋电小室的步骤为：

14、按趋电小室的设计图，在细胞培养皿上使用真空硅润滑脂和盖玻片制作趋电小室；

15、按照所述设计图在培养皿背面用记号笔将趋电小室进行分区，形成含有多个独立的细胞接种区的趋电小室。

16、进一步地，将饥饿处理后的盘基网柄菌细胞接种到每个独立的细胞接种区中，包括以下步骤：

17、将饥饿处理后的盘基网柄菌细胞进行重悬得到细胞悬液；

18、分别取2μl细胞悬液接种到趋电小室的每个细胞接种区中，贴壁5min，盖上盖玻片，加入db缓冲液以保证直流电场通电；

19、其中，所述db缓冲液的配方为：1.269g/lna2hpo4，0.680g/lkh2po4，0.32g/lmgso4，0.022g/lcacl2，ddh2o定容至1l，调节ph为6.5。

20、进一步地，将接种有盘基网柄菌细胞的趋电小室与缓冲液进行电性连接的步骤为：

21、将趋电小室水平放置于显微镜的载物台上，使用导电性琼脂盐桥将缓冲液和趋电小室连接，电源通过浸泡在缓冲液中的碳棒与趋电小室连通；

22、其中，所述缓冲液为1×steinbergs缓冲液。

23、进一步地，所述1×steinbergs缓冲液的配制方法为：

24、配制10×steinbergs缓冲液：35.064g/lnacl，0.522g/lkcl，1.972g/lmgso4，0.708g/lca(no3)2，1.696g/ltrizmabase，ddh2o定容至1l，调节ph为7.5；

25、使用时将配制的所述10×steinbergs缓冲液用双蒸水稀释至1×steinbergs缓冲液。

26、进一步地，对录像数据进行分析包括分析盘基网柄菌细胞在直流电场中的运动方向、方向持续性、平均轨迹速度和平均位移速度。

27、本发明的有益效果：

28、本发明提出的高通量筛选细胞趋电性运动情况的方法，通过减少细胞悬液和盘基网柄菌易贴壁的优点，趋电小室内可以同时种植数十种突变株，大大提高了效率，且该方法操作简单，效率高，成本低，不仅可以适用于突变株库的筛选，还可以适用于remi突变库筛选、crispr/cas9基因编辑细胞的表型筛选。

29、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

技术特征：

1.一种高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

4.根据权利要求3所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

5.根据权利要求3所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

6.根据权利要求1所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

7.根据权利要求1所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

8.根据权利要求1所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

9.根据权利要求8所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

10.根据权利要求1-9任一项所述的高通量筛选细胞运动情况的方法，其特征在于，

技术总结
本发明属于细胞运动筛选领域，具体公开了一种高通量筛选细胞运动情况的方法，包括以下步骤：将无菌培养至指数生长阶段的盘基网柄菌细胞进行饥饿处理；制作包含多个独立的细胞接种区的趋电小室，将饥饿处理后的盘基网柄菌细胞接种到每个独立的细胞接种区中；将接种有盘基网柄菌细胞的趋电小室与缓冲液进行电性连接，利用多点实时录像系统分别聚焦于每个细胞接种区中的盘基网柄菌细胞完成录像；对录像数据进行分析，并根据分析结果完成对盘基网柄菌细胞运动情况的筛选。该方法可以在趋电小室内同时种植数十种突变株，大大提高了效率，不仅适用于突变株库的筛选，还适用于REMI突变库筛选、CRISPR/Cas9基因编辑细胞的表型筛选。

技术研发人员：高润池,施利民,王晓燕
受保护的技术使用者：云南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16