SOD突变体及其在重组芽孢杆菌的表达方法和在制备美白化妆品中的应用与流程

本发明属于生物工程，具体涉及sod突变体及其在重组芽孢杆菌的表达方法和在制备美白化妆品中的应用。

背景技术：

1、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)可催化超氧阴离子与氢反应，产生氧气和过氧化氢，是一种重要抗氧化剂，其在保护细胞免受氧自由基的毒性方面发挥着关键作用。sod常以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅助因子的形式存在。几乎所有真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶(cu-zn-sod，sod1)；几乎所有的线粒体和许多细菌(如大肠杆菌)均含有结合锰的超氧化物歧化酶(mn-sod，sod2)；大肠杆菌和其他一些细菌还含有结合铁的超氧化物歧化酶(fe-sod)，也有一些细菌只含fe-sod或mn-sod。人体中sod有二类，一是位于细胞质和胞外中结合铜离子和锌离子的sod1，占总sod的80％以上，另一类是位于线粒体中结合mn离子的sod2，人体内不含原核生物的fe-sod及少数原始细菌中所含有的ni-sod。seguíj等人在临床上已证明sod对结肠炎具有较好疗效。在化妆品中，vozenin-brotons mc等人提到可用来清除对皮肤造成损害的自由基，减少肌成纤维细胞的表型逆转来减少纤维化。

2、胡杨(populus euphratica)又称胡桐、英雄树、异叶胡杨、异叶杨、水桐、三叶树，是杨柳科杨属胡杨亚属的一种植物，常生长在沙漠中，它耐寒、耐旱、耐盐碱、抗风沙，有很强的生命力。胡杨[cuzn]sod中包含两段保守his42–pro65和ser110-gly154片段，同时胡杨[cuzn]sod也具有其他[cuzn]sod同样保守的络合cu2+和zn2+的氨基酸(his-45,his-47,his-62,his-70,his-79,his-119,asp-82)和两个保守半胱氨酸(cys-56和cys-145)。银光委陵菜[cuzn]sod(pasod)第95位含有第3个半胱氨酸(c)，而其他的在该位置是苏氨酸(t)或赖氨酸(k)，kumar等人把第95位半胱氨酸突变成丙氨酸(c95a)后，研究表明具有更好的耐热性；但是其耐热性程度还是无法满足实际规模化生产的需要。

3、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢；枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；同时芽孢杆菌具有较高的蛋白合成与分泌能力，易于胞外分泌目的蛋白，可直接在胞外培养基中收集生产的目的蛋白；且芽孢杆菌对人及其它动物没有致病性；故将枯草芽孢杆菌应用于sod突变体的表达系统中具有重要的意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种sod突变体在重组芽孢杆菌的表达方法，其方法简单，易于操作，有效提高sod突变体的产率，并使sod突变体具有良好的稳定性。

2、本发明的目的之二在于提供一种sod突变体，od突变体具有耐热性强，稳定性高，渗透能力强的特点。

3、本发明的目的之三在于提供一种sod突变体在制备美白化妆品中的应用。

4、本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

5、一种sod突变体在重组芽孢杆菌的表达方法，包括以下步骤：

6、(1)根据目的sod突变体的氨基酸序列，按照枯草芽孢杆菌优化密码子及mrna高级结构后，人工合成cdna；所述cdna的核苷酸序列如seq idno:4或seq id no:5所示；

7、(2)将所述cdna序列克隆至pht1469质粒中，构建重组载体；

8、(3)将所述重组载体转入枯草芽孢杆菌中，诱导表达，得到sod突变体。

9、进一步地，步骤(1)中，目的sod突变体包括氨基酸序列如seq id no:1所示的sod突变体及其n端或c端修饰得到的sod衍生突变体。

10、进一步地，所述sod突变体由氨基酸序列如seq id no:2所示的超氧化物歧化酶定点突变而成；所述定点突变包括：将所述超氧化物歧化酶的第9位的天冬酰胺突变成丝氨酸，第15位的天冬酰胺突变成赖氨酸，第41位的脯氨酸突变成亮氨酸。

11、进一步地，所述sod衍生突变体由所述sod突变体n端或c端去掉1-9个氨基酸后修饰多肽制得。

12、进一步地，所述sod衍生突变体的氨基酸序列如seq id no:3所示。

13、进一步地，步骤(3)中，具体操作为：将所述重组载体电转入感受态枯草芽孢杆菌后，培养得到表达sod突变体的重组芽孢杆菌，诱导表达，得到sod突变体。

14、进一步地，诱导表达的操作为：将重组芽孢杆菌接入含15-25μg/ml氯霉素的lb培养基中，在28-32℃、200-300rpm条件下摇床培养至od600＝0.8-1.0，按1:80-120接入含15-25μg/ml氯霉素的诱导培养基中，在28-32℃、200-300rpm条件下摇床培养至od600＝0.8-1.0，加入0.8-1.2mm iptg诱导表达，得到sod突变体。

15、进一步地，所述诱导培养基包括以下组分：

16、胰蛋白胨1.4-1.8wt％，酵母提取物0.3-0.7wt％，葡糖糖1.5-2.5wt％，tween400.2-0.4wt％，无机盐90-120mm；

17、其中，按摩尔百分比计，所述无机盐包括：fecl3 48-52％，cacl2 18-22％，

18、mncl2 8-12％，znso4 8-12％，cocl2 1-3％，cucl2 1-3％，nicl2 1-3％，na2moo41-3％，h3bo31-3％。

19、本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

20、一种sod突变体，由所述的sod突变体在重组芽孢杆菌的表达方法所得。

21、本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

22、一种sod突变体的应用，所述sod突变体在重组芽孢杆菌的表达方法得到的sod突变体在制备美白化妆品中的应用。

23、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

24、本发明的一种sod突变体在重组芽孢杆菌的表达方法，其方法简单，易于操作；按照枯草芽孢杆菌优化密码子及mrna高级结构后的人工合成cdna后，与枯草芽孢杆菌构建得到重组芽孢杆菌，有效提高sod突变体的产率，保持sod突变体的完整活性；sod突变体为以超氧化物歧化酶为模板，经多点突变(n9s,n15k,p41l)获得，其耐热性大幅提升，协同重组芽孢杆菌的表达系统，能高效生产sod突变体，且sod突变体的耐热性强、稳定性高，可长期保藏。

25、本发明的一种表达sod突变体，其具有耐热性强，稳定性高，渗透能力强的特点，且分子量小，容易被吸收。

26、本发明的一种sod突变体在制备美白化妆品中的应用。sod突变体的抗氧化性强，能有效去除氧自由基以保护细胞，且渗透能力强，分子量小，容易被皮肤吸收利用，在制备美白化妆品的领域中具有良好的应用前景。