一种发酵法制备D-泛酸的方法与流程

本发明涉及微生物发酵，具体涉及一种发酵法制备d-泛酸的方法。

背景技术：

1、d-泛酸(d-pantothenic acid，dpa)是一种重要的水溶性维生素，应用于制药、食品、化妆品、饲料等行业。dpa是维生素b复合物的成员，其是哺乳动物天然所需要的。细胞中，dpa主要用于辅酶a(coa)和酰基载体蛋白(acp)的生物合成。目前，dpa的制备主要分为化学-酶法以及生物发酵法两种制备方法，化学法制备工艺较为复杂、且容易造成工业污染等。

2、近年来随着技术理念的发展，环保和成本的限制，d-泛酸发酵生产变得越来越可行。现有的对微生物发酵法的研究主要集中在菌种构建以及代谢研究，比如通过增强dpa合成途径中各种酶基因(panb、panc等)的表达或者是削弱dpa合成的竞争支路等方式构建多种生物工程菌以合成dpa。但，由于不同代谢途径之间的非线性关系，以及辅助因子与主要代谢途径之间的竞争与协作，代谢工程改造往往从多个角度进行，因而构建新的更加高产的菌株以进一步提高d-泛酸的产量较为困难。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种制备工艺简单、产量高且杂质少的发酵法制备d-泛酸的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种发酵法制备d-泛酸的方法，在利用d-泛酸生产菌株发酵生产d-泛酸的过程中，向发酵体系中添加甲基供体，同时添加甲基供体的载体。

4、优选地，所述甲基供体为氯化胆碱、多聚甲醛、蛋氨酸、甜菜碱和甲酸中的一种或多种。

5、优选地，所述甲基供体的载体为叶酸。

6、优选地，控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.02g/l～2g/l，例如，0.08g/l，0.16g/l，0.2g/l，0.3g/l，0.46g/l，0.5g/l，1.2g/l，1.4g/l，1.6g/l等。

7、进一步优选地，控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/l～1g/l。

8、更进一步优选地，控制所述叶酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/l～0.5g/l。

9、优选地，控制所述甲基供体在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/l～5g/l。

10、优选地，控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/l～5g/l，例如，0.8g/l，1.2g/l，1.6g/l，2.2g/l，2.6g/l，3.4g/l，3.8g/l，4.4g/l，4.6g/l等。

11、进一步优选地，控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为1g/l～3g/l。

12、更进一步优选地，控制所述氯化胆碱在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/l～2.5g/l。

13、优选地，控制所述多聚甲醛在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/l～3g/l，例如，0.3g/l，0.8g/l，1.2g/l，1.6g/l，2.2g/l，2.6g/l等。

14、进一步优选地，控制所述多聚甲醛在所述发酵体系中的起始浓度为0.1g/l～2g/l。

15、更进一步优选地，控制所述多聚甲醛在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/l～2g/l

16、优选地，控制所述蛋氨酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/l～5g/l，例如，0.8g/l，1.2g/l，1.6g/l，2.2g/l，2.6g/l，3.4g/l，3.8g/l，4.4g/l，4.6g/l等。

17、进一步优选地，控制所述蛋氨酸在所述发酵体系中的起始浓度为1g/l～3g/l。

18、更进一步优选地，控制所述蛋氨酸在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/l～2.5g/l。

19、优选地，控制所述甜菜碱在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/l～5g/l，例如，0.8g/l，1.2g/l，1.6g/l，2.2g/l，2.6g/l，3.4g/l，3.8g/l，4.4g/l，4.6g/l等。

20、进一步优选地，控制所述甜菜碱在所述发酵体系中的起始浓度为1g/l～3g/l。

21、更进一步优选地，控制所述甜菜碱在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/l～2.5g/l。

22、优选地，控制所述甲酸在所述发酵体系中的起始浓度为0.5g/l～5g/l，0.8g/l，1.2g/l，1.6g/l，2.2g/l，2.6g/l，3.4g/l，3.8g/l，4.4g/l，4.6g/l等。

23、进一步优选地，控制所述甲酸在所述发酵体系中的起始浓度为1g/l～3g/l。

24、更进一步优选地，控制所述甲酸在所述发酵体系中的起始浓度为1.5g/l～2.5g/l。

25、优选地，在所述发酵生产的过程中第10～35小时向所述发酵体系中加入所述甲基供体或者同时添加所述甲基供体的载体。

26、进一步优选地，在所述发酵生产的过程中第18～26小时向所述发酵体系中加入所述甲基供体或者同时添加所述甲基供体的载体。

27、更进一步优选地，在所述发酵生产的过程中第19～22小时向所述发酵体系中加入所述甲基供体或者同时添加所述甲基供体的载体。

28、优选地，所述发酵生产的底物为葡萄糖。

29、优选地，所述葡萄糖在所述发酵体系中的起始浓度为15g/l～30g/l，例如，16g/l，22g/l，26g/l，28g/l等。

30、进一步优选地，所述葡萄糖在所述发酵体系中的起始浓度为18g/l～25g/l。

31、优选地，当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于5g/l，向所述发酵体系投加葡萄糖。

32、优选地，当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于设定值(5g/l)时，向所述发酵体系投加葡萄糖至所述葡萄糖在所述发酵体系中的浓度为15g/l～30g/l。

33、进一步优选地，当所述发酵体系中所述葡萄糖浓度低于设定值时，向所述发酵体系投加葡萄糖至所述葡萄糖在所述发酵体系中的浓度为15g/l～26g/l。

34、优选地，所述发酵体系中还包括其他组份，所述其他组份及所述其他组份在所述发酵体系中的起始浓度分别为：硫酸铵5g/l～20g/l，磷酸二氢钾1g/l～5g/l，硫酸镁1.2g/l～3.0g/l，酵母提取物2g/l～8.0g/l，mops 60g/l～100g/l以及微量元素2ml/l～8ml/l，溶剂为去离子水。

35、进一步优选地，所述其他组份及所述其他组份在所述发酵体系中的起始浓度分别为：硫酸铵8g/l～15g/l，磷酸二氢钾1.5g/l～3g/l，硫酸镁1.5g/l～2.5g/l，酵母提取物3g/l～6.0g/l，mops 70g/l～90g/l以及微量元素3ml/l～6ml/l，溶剂为去离子水。

36、优选地，feso4·7h2o 8g/l～15g/l、cacl2 1g/l～2g/l、znso4·7h2o 2g/l～3g/l、mnso4·4h2o 0.1g/l～1g/l、cuso4·5h2o 0.5g/l～2g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o 0.05g/l～0.2g/l、na2b4o7·10h2o 0.1g/l～0.5g/l、cocl2·6h2o 0.2g/l～0.8g/l、30％～40％ hcl8ml/l～15ml/l。

37、进一步优选地，所述微量元素包括feso4·7h2o 9g/l～12g/l、cacl2 1.2g/l～1.6g/l、znso4·7h2o 2.1g/l～2.6g/l、mnso4·4h2o 0.3g/l～0.8g/l、cuso4·5h2o 0.8g/l～1.5g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o 0.08g/l～0.15g/l、na2b4o7·10h2o 0.1g/l～0.3g/l、cocl2·6h2o 0.3g/l～0.5g/l、32％～36％ hcl 9ml/l～12ml/l。

38、优选地，所述发酵生产的时间为35～50小时。

39、进一步优选地，所述发酵生产的时间为38～45小时。

40、优选地，所述发酵生产的条件为：温度为36℃～38℃，ph为6.8～7.0，转速为210rpm～250rpm。

41、进一步优选地，所述发酵生产的条件为：温度为36.5℃～37.5℃，ph为6.8～7.0，转速为210rpm～230rpm。

42、优选地，所述生产菌株为通过基因工程构建的工程菌e.coli mg1655avta:pandbl-ilvg+m-aspdh/pacyc184-panbce。

43、优选地，所述制备d-泛酸的方法的具体步骤为：

44、(1)活化生产，将所述生产菌株接种到平板培养基活化生产菌株；

45、(2)种子生产，将步骤(1)得到的生产菌株接种至种子培养基进行种子生产，获得种子液；

46、(3)发酵生产，将步骤(2)得到的种子液接种至所述发酵体系进行发酵培养；发酵培养过程中，每隔3～5小时，用氨水调节发酵体系的ph，使发酵体系的ph为6.8～7.0；用生物传感分析仪检测发酵体系中葡萄糖的含量，当发酵体系中葡萄糖浓度低于5g/l时，向发酵体系投加葡萄糖，控制发酵体系中葡萄糖的浓度为15g/l～30g/l；在发酵生产的过程中第18～26小时向发酵体系中加入甲基供体的同时添加甲基供体的载体。

47、进一步优选地，发酵培养过程中，每隔3.5～4.5小时用氨水调节发酵体系的ph。

48、优选地，所述种子液接种量为所述发酵体系体积的2％～6％。

49、进一步优选地，所述种子液接种量为所述发酵体系体积的2.5％～5％。

50、与现有技术相比，本发明具有如下优势：

51、本发明通过额外向发酵培养体系中添加甲基供体和甲基供体的载体，有效提高了d-泛酸的合成产量，降低了杂质含量。而且本发明提供的制备工艺简单，且添加的甲基供体和甲基供体的载体容易得到，成本较低。