一种TEM1基因的检测方法及其在结直肠癌检测中的应用与流程

一种tem1基因的检测方法及其在结直肠癌检测中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种tem1基因的检测方法及其在结直肠癌检测中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是消化系常见恶性肿瘤，也是第二大致死的癌症在全世界范围内，每年都有很多人被诊断出患有crc，也有很多患者死于此病。尽管现有的治疗手段(包括手术、放射疗法、化学疗法)对crc具有显著的临床治疗价值，然而，手术后癌症的复发和转移使得这些治疗手段不能成功治愈结直肠癌。因此，对crc早期的诊断不仅可以降低死亡率，还可以减少手术治疗的费用。
3.dtem1是1型跨膜的肿瘤血管标记蛋白，含有809kda核心蛋白，在糖基化修饰后可以成为175kda的成熟糖蛋白。tem1最早发现在肿瘤血管相关的周细胞和肌成纤维细胞中。之后在多种肿瘤的内皮细胞中均发现有表达。研究tem1在结直肠癌组织中的表达对于结直肠癌的早诊断具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种tem1基因的检测方法及其在结直肠癌检测中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现，tem1 mrna在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达量不同，其在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，表明tem1可能是一个预测结直肠癌的生物标志物，有可能会成为结直肠癌基因治疗的潜在靶点。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种结直肠癌早期诊断的生物标志物，所述生物标志物为tem1。
7.本发明提供一种检测tem1表达量的试剂在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用。
8.进一步地，所述产品为试剂盒或试剂。
9.本发明还提供一种结直肠癌早期诊断产品，包括检测tem1表达量的试剂。
10.进一步地，所述产品为试剂盒或试剂。
11.进一步地，所述试剂包括荧光定量pcr检测的引物对，所述试剂包括荧光定量pcr检测的引物对和探针，所述引物对的上游引物为tcctggtgccaacgtgtgt，下游引物为agcagtcagtgatgcgcttgt，所述探针的核苷酸序列为cctgcttgcactgggcatcgtgtac。
12.本发明还提供一种tem1基因的检测方法，所述检测方法采用荧光定量pcr检测，所述荧光定量pcr检测使用的引物对的上游引物为tcctggtgccaacgtgtgt，下游引物为agcagtcagtgatgcgcttgt。
13.进一步地，所述荧光定量pcr检测的内部对照采用gapdh。
14.进一步地，检测所述gapdh的引物对的上游引物为cttagcacccctggccaag，下游引物为gatgttctggagagccccg。
15.本发明还提供上述的方法在结直肠癌检测中的应用。
16.本发明公开了以下技术效果：
17.本发明研究发现，tem1 mrna在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达量不同(1.3380
±
0.2367vs0.9012
±
0.1498)，差异有统计学意义，其在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，表明tem1可能是一个预测结直肠癌的生物标志物，有可能会成为结直肠癌基因治疗的潜在靶点。
具体实施方式
18.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
19.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
20.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
21.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
22.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
23.实施例1
24.1.方法
25.1.1总rna提取
26.利用trizol rna提取试剂(美国gibco公司)对结直肠癌组织进行总rna提取。
27.1.2荧光定量pcr
28.1.2.1引物和探针
29.检索ncbi genbank数据库获得目的基因(tem1)及内参基因(gapdh)的全长序列，利用引物和探针设计软件primer express设计引物序列(见表1)，设计引物经blast分析具有特异性。taqman荧光标记探针序列与相应引物互补(序列见表2)。所用引物及taqman荧光标记探针均由上海生工公司合成。
30.表1引物和探针序列
[0031][0032]
1.2.2反转录
[0033]
以总rna为模板，利用反转录试剂盒进行反转录反应合成cdna，整个反应液配制过程在冰上进行。
[0034]
1.2.3荧光定量pcr反应体系和反应程序
[0035]
荧光定量pcr反应体系见表2。
[0036]
表2
[0037][0038][0039]
整个反应液的配制过程在冰上进行。将配好的pcr反应液充分混匀后，分装入毛细管后用离心机轻轻离心后放入light cycler中进行real time pcr反应。目的基因(tem1)与内参(gapdh)同时进行pcr扩增反应。采用两步法pcr反应程序预变性:95℃10s；95℃5s，60℃20s，40cycle。
[0040]
1.2.4pcr反应结果分析
[0041]
反应结束后根据各扩增曲线读取到的ct值，进行结果分析，对实验样本进行相对定量。按照下列公式对样品中tem1mrna的相对表达量进行计算：
[0042]
△
ct(目的基因)＝ct(目的基因)-ct(内参)；
[0043]
△△
ct＝
△
ct(目的基因)
‑△
ct(标准值)；
[0044]
目的基因的相对量为2
‑△△
ct
。
[0045]
其中，ct值是指pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的
扩增循环次数。
[0046]
1.3统计处理
[0047]
采用spss17.0统计软件包进行统计学处理。所有数据以
ⅹ±
se表示，肿瘤组织与对应的癌旁组织两组之间的均数比较采用t检验。肿瘤的临床病例参数之间的比较采用单因素方差分析。所有实验重复三次。均采用双侧检验，设定p《0.05有统计学意义。
[0048]
2.结果
[0049]
2.1总rna纯度及质量分析
[0050]
本发明对70例样本癌组织及癌旁组织进行总rna提取，均进行紫外分光光度计检测，od
260
/od
260
的比值位于1.8～2.0之间，纯度合格。2％的琼脂糖凝胶电泳显像显示清晰的28s和18ss两条带，无明显的5s条带降解，说明提取的rna完整性较好。
[0051]
2.2tem1 mrna在不同组织中的表达
[0052]
根据目的基因及内参的ct值得出2
‑△△
ct
，即目的基因mrna的相对量(见表3)，经统计学分析表明，tem1mrna在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达量不同(1.3380
±
0.2367vs0.9012
±
0.1498)，差异有统计学意义，其在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，t＝2.358，p0.022《0.05。
[0053]
表3
[0054][0055]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。