一种冻干型甲型和乙型流感病毒的双重RT-PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种冻干型甲型和乙型流感病毒的双重rt-pcr检测试剂盒，属于流感病毒检测。

背景技术：

1、流行性感冒(influenza)简称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，发病率高。流感病毒属rna病毒，可分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型。a型流感病毒常以流行形势出现，宿主范围很广，能感染包括人以内的多种动物(猪、马、狗、禽类和海豹等)，也曾经多次引起世界性的人流感大流行。b型流感病毒常引起局部爆发。c型流感主要以散在形式出现，一般不引起流行。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的h1n1，h3n2亚型以及乙型流感病毒中的victoria和yamagata系。

2、在流感流行季，排查流感的主要依据是症状，但由于流感的症状、体征缺乏特异性，容易和普通感冒和其他上呼吸道感染相混淆。由此可能带来临床误诊率高、抗生素滥用、药源性疾病增加等风险。因此，想要确诊流感的话，仍然依赖于病毒核酸检测、病毒分离培养、抗原检测和血清学检测等检测方法。

3、常见的甲型和乙型流感病毒的检测方法是rt-pcr。rt-pcr具有高特异性和光谱技术的高精确性，且取材简单，操作方便等优点。但是，现有的检测甲型和乙型流感病毒的rt-pcr检测方法往往由于甲型和乙型流感病毒的检测试剂之间存在相互干扰，只能将甲型和乙型流感病毒分开检测，增加了检测的工作量，降低了检测的效率，不利于在流感高发期的应用。

4、另外，在rt-pcr的基础上对反应体系进行真空冷冻干燥，以下简称冻干，冻干的目的就是在低温、真空环境中除去物质中的自由水和一部分吸附于固体晶格间隙中的结合水。冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链，即时活化，不相容试剂共存，无交叉污染等优点，保证了试剂稳定性以及减低运输要求，使得试剂盒的运输，保存以及操作更为简单。但是，现有的rt-pcr冻干试剂的含水量难以满足要求，以致影响了检测试剂的检测性能。

技术实现思路

1、本发明提供了一种冻干型甲型和乙型流感病毒的双重rt-pcr检测试剂盒，可以有效解决上述问题

2、本发明是这样实现的：

3、一种冻干型甲型和乙型流感病毒的双重rt-pcr检测试剂盒，包括以下组分：rt-pcr缓冲液、冻干缓冲液、dna聚合酶、rnase抑制剂、甲型流感病毒rt-pcr的引物和探针、乙型流感病毒rt-pcr的引物和探针、dntp；所述冻干缓冲液包括甜菜碱、海藻糖、pvp30、peg35k、蔗糖及bsa；其制备方法为，将各组分进行制珠，放入冻干机中进行冻干。

4、作为进一步改进的，所述冻干缓冲液各组分的含量为甜菜碱0.05-2μm，海藻糖0.1％-5wt％，pvp30 0.1％-5wt％，peg35k 0.05％-7wt％，蔗糖0.1％-6wt％，bsa0.1％-3wt％。

5、作为进一步改进的，所述dna聚合酶包括rna依赖的dna聚合酶m-mlv及taqdna聚合酶。

6、作为进一步改进的，所述m-mlv的浓度为0.05-0.3u/μl；taqdna聚合酶的浓度为0.05-0.5u/μl。

7、作为进一步改进的，所述甲型流感病毒rt-pcr的引物和探针包括引物1、引物2和探针1，其核苷酸序列依次为seq id no:1-3；所述乙型流感病毒rt-pcr的引物和探针包括引物3、引物4和探针2，其核苷酸序列依次为seq id no:4-6。

8、作为进一步改进的，所述冻干的冻干曲线为预冻阶段：-50℃、2h、真空度0pa；-40℃、2h、真空度0pa；-50℃、3h、真空度0pa；升华干燥：-40℃、0.5h、真空度10pa；-40℃、5h、真空度10pa；-30℃、0.5h、真空度10pa；-30℃、5h、真空度10pa；-20℃、0.5h、真空度10pa；-20℃、1.5h、真空度10pa；-10℃、0.5h、真空度10pa；-10℃、1h、真空度10pa；-10℃、1h、真空度10pa；解析干燥：0℃、0.5h、真空度10pa；10℃、2h、真空度10pa；20℃、2h、真空度10pa。冻干原理：在rt-pcr的基础上对反应体系进行真空冷冻干燥，以下简称冻干，冻干的目的就是在低温、真空环境中除去物质中的自由水和一部分吸附于固体晶格间隙中的结合水。冷冻干燥分为三个步骤：预冻阶段、升华干燥、解吸干燥，升华干燥也称第一步干燥，解吸干燥也称第二步干燥。在第一步干燥中，冰不是从物质的所有部分同时蒸发，而是存在一个交界面，始终从干燥外层边界向内移动。在第二步干燥中去除由第一步干燥留下的少量百分比的不冻结水或局部结合水，减少到有利于产品贮存的最佳数值。本技术的冻干曲线能够保证冻干试剂可获得外型完整圆润，水分低于2％的冻干小球，且保证了试剂的性能。

9、作为进一步改进的，包括甲型流感病毒rt-pcr的引物和探针、乙型流感病毒rt-pcr的引物和探针；所述甲型流感病毒rt-pcr的引物和探针包括引物1、引物2和探针1，其核苷酸序列依次为seq id no:1-3；所述乙型流感病毒rt-pcr的引物和探针包括引物3、引物4和探针2，其核苷酸序列依次为seq id no:4-6。

10、一种冻干缓冲液，包括甜菜碱0.05-2μm，海藻糖0.1％-5wt％，pvp300.1％-5wt％，peg35k 0.05％-7wt％，蔗糖0.1％-6wt％，bsa0.1％-3wt％。其中甜菜碱可抑制反应中的非特异性扩增，海藻糖和蔗糖可在冻干失水过程中保护蛋白的同时，作为骨架为小球赋形，bsa主要为保护蛋白作用，pvp30和peg35k主要作为骨架支持冻干赋形，同时促进rt-pcr反应。

11、一种上述的冻干型甲型和乙型流感病毒的双重rt-pcr检测试剂盒的应用方法，将样品核酸加入所述试剂盒，进行实时荧光pcr；若检测结果ct≤40，且有明显指数增长期，则为阳性；反之，则为阴性。

12、作为进一步改进的，实时荧光pcr的程序为：逆转录50℃、10min、1个循环；灭活95℃、8min、1个循环；解链95℃、3s、40个循环；退火延伸60℃、20s、40个循环。

13、本发明的有益效果是：

14、本发明从大量的引物探针中筛选出具有高灵敏度和高特异性的引物探针，本发明使用的引物探针可分别特异性识别甲型流感和乙型流感，且二者互不干扰，互不影响。本发明试剂盒可以同时检测出样本中的甲流流感病毒和乙型流感病毒。本产品灵敏度高，检测lod低至50copies/rxn，精密度好。本发明产品适用于流感时期的筛查，帮助医生快速判断病人是否感染甲型或者乙型流感，以便后续的精准治疗。

15、本发明的使用的探针法，在甲型流感病毒的探针标记fam荧光，乙型流感病毒的探针标记vic荧光，在各自的引物探针的作用下，识别甲型流感病毒或者乙型流感病毒的模板，进行扩增，释放出不同的荧光信号，可实现双重实时荧光。

16、本发明经过多次对比实验获得的冻干保护剂以及冻干曲线有效的保证了本发明试剂的稳定性，灵敏度，特异性，精密度等性能。冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链，即时活化，不相容试剂共存，无交叉污染等优点，保证了试剂稳定性以及减低运输要求，使得试剂盒的运输，保存以及操作更为简单，节约成本的同时，保证试剂盒的性能。