一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其应用

：本发明属于活性肽领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其制备方法与应用。

背景技术

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背景技术：

1、葛根,为豆科植物野葛的干燥根,其始载于我国汉代的《神农本草经》,具有降血压、降血糖、抗肿瘤、解酒护肝等功效。2002年葛根被国家卫生部正式批准成为首批药食同源植物，市场上出现了大批含有葛根的保健食品，具有较高的经济价值和应用价值。目前的研究人员主要研究葛根黄酮类、三萜类、香豆素类化合物等成分的功效作用，但关于葛根蛋白及葛根多肽的制备及抗氧化活性的研究报道较为少见，尤其是具有抗氧化活性的多肽氨基酸，目前尚未报道。

2、葛根蛋白作为一种属于豆科植物蛋白的食源性蛋白，富含人体不能合成的必需氨基酸。但由于蛋白质具有结构复杂且分子量大的特点，摄入人体后难以发挥其营养价值。因此，以葛根为原料，通过定向酶解及分离纯化将葛根蛋白制备成易于消化吸收的具有抗氧化活性的多肽，对葛根蛋白深入研究及产品开发具有重要意义，同时对提升葛根蛋白的附加价值和拓展产品应用领域具有现实意义。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的首要目的在于提供一种具有抗氧化活性的葛根多肽，所述葛根多肽的氨基酸序列为ylwvga，即tyr-leu-trp-val-gly-ala，其分子量为708.37da。

2、本发明的另一目的在于提供上述ylwvga多肽的应用，特别是在作为抗氧化剂或在制备抗氧化产品中的应用，更特别的是在制备具有抗氧化功效的功能食品或保健品中的应用。

3、本发明提供的葛根多肽ylwvga，可以采用固相化学合成技术合成获得。也可以以葛根为原料，通过酶解和分离纯化获得，具体地，包括以下步骤：

4、(1)葛根蛋白提取：采用酶法水解提取葛根蛋白，具体流程如下，将葛根粉过60目筛去除杂物，按照质量体积比1:20加入去离子水，加入葛根粉质量2％(w/w)的纤维素酶，调ph值至5.0，酶解温度为50℃，酶解时间为2h，酶解完成后100℃灭酶10min。后将ph值调至8.0-9.0，50℃水浴振荡浸提1-2h得提取液，将提取液4000r/min离心10min，将所得的上清液调节ph值至3.5-4.5，静置后取沉淀，冷冻干燥获得葛根蛋白。

5、(2)葛根蛋白酶解：将葛根蛋白加入去离子水进行溶解，葛根蛋白浓度为2-4％，加入葛根蛋白质量4-6％(w/w)的蛋白酶，酶解时间为4-6h，酶解温度为55℃，ph值为8.0；酶解结束后100℃灭酶10min，离心后取上清液为葛根蛋白酶解液。

6、(3)葛根多肽分离纯化：对葛根蛋白酶解液进行超滤分离，对超滤处理后分子量<3kda的组分依次采用sephadex g-15葡聚糖凝胶柱和deae-52阴离子交换层析柱进行下一步分离纯化。收集合并成多个洗脱峰组分，选择抗氧化活性较强组分进行反向高效液相色谱纯化，收集各个洗脱峰组分，冷冻干燥-20℃保存备用。

7、(4)葛根多肽序列鉴定：收集反向高效液相色谱分离的具有最佳抗氧化活性的洗脱峰组分，采用液相色谱-串联质谱法进行氨基酸序列测定，获得可信度较高的肽段，氨基酸序列分别为ylwvga、llvyy、dvlpla和vlsalp。采用固相化学合成技术，依次合成肽段，比较各个合成肽段的抗氧化活性。

8、优选地，得到氨基酸序列为ylwvga的多肽具有最优的抗氧化活性，其在2mg/ml浓度下的dpph自由基清除率为74.57±0.72％，abts自由基清除率为68.53±0.61％，羟自由基清除率为75.73±0.79％；并且ylwvga干预对乙醇诱导hepg2细胞氧化损伤有较好的保护作用，尤其在提高细胞存活率，降低alt、ast和ldh释放量，提高cat、gsh-px和sod活力方面效果显著。

9、进一步地，步骤(2)所述蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的一种以上。优选地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比为3:1组成的复合蛋白酶。

10、优选地，步骤(2)酶解条件为：底物浓度为3％，加酶量为5％，ph值为8.0，酶解温度为55℃，酶解时间为5h。

11、进一步地，步骤(3)所述sephadex g-15葡聚糖凝胶柱分离，洗脱液为去离子水，流速为1ml/min，检测波长为220nm，每管收集5ml；收集并测定各个洗脱组分抗氧化活性。

12、进一步地，步骤(3)所述deae-52阴离子交换层析柱分离，采用0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l和0.4mol/l的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速为2ml/min，检测波长为220nm，每管收集5ml；收集并测定各个洗脱组分抗氧化活性。

13、本发明的有益效果为：

14、(1)本发明采用纤维素酶辅助提取葛根蛋白，提高了蛋白提取率，提取率达42.05％。

15、(2)本发明采用超滤分离、凝胶柱层析和反向高效液相色谱技术协同对葛根多肽分离纯化，所得到的多肽纯度更高。并且以hepg2细胞存活率作为判别指标筛选活性较强的组分，能精准用于具有抗氧化活性的葛根多肽的制备，方法简单，实用性强。

16、(3)本发明的多肽ylwvga对乙醇诱导hepg2细胞氧化损伤具有显著保护作用，并且通过降低alt、ast和ldh释放量，提高抗氧化酶的活力来抑制乙醇诱导的氧化应激，进而发挥保护hepg2细胞氧化损伤活性。

17、(4)本发明提供的天然多肽ylwvga具有抗氧化活性强，分子量小，易于消化吸收等优点，能够应用于缓解氧化应激损伤的功能食品或保健品中。

技术特征：

1.一种具有抗氧化活性的葛根多肽，其特征在于，所述葛根多肽的氨基酸序列为ylwvga，即tyr-leu-trp-val-gly-ala。

2.权利要求1所述葛根多肽的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是所述葛根多肽在作为抗氧化剂或在制备抗氧化产品中的应用。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是所述葛根多肽在制备具有抗氧化功效的功能食品或保健品中的应用。

技术总结
本发明属于活性肽领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的葛根多肽及其制备方法与应用。所述葛根多肽的氨基酸序列为YLWVGA，即Tyr‑Leu‑Trp‑Val‑Gly‑Ala。本发明的多肽YLWVGA对乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤具有显著保护作用，并且通过降低ALT、AST和LDH释放量，提高抗氧化酶的活力来抑制乙醇诱导的氧化应激，进而发挥保护HepG2细胞氧化损伤活性。本发明提供的天然多肽YLWVGA具有抗氧化活性强，分子量小，易于消化吸收等优点，能够应用于缓解氧化应激损伤的功能食品或保健品中。

技术研发人员：杜冰,梁结桦,黎攀,廖琛,罗贝孛
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12