韩国芽孢杆菌以及提高其产生的酶的活力的培养基的制作方法

1.本技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种细菌培养基及其用途，尤其是在提高细菌产生的酶的活力，或者在延缓所述酶的活力下降的速度，或者在延长所述酶的活力下降的时间中的用途。本技术还涉及一种方法，所述方法能够提高细菌产生的酶的活力，或者延缓所述酶的活力下降的速度，或者延长所述酶的活力下降的时间。


背景技术：

2.韩国芽孢杆菌是一类菌落为黄色、内生孢子的杆状细菌，2006年首次被韩国学者lim jee-min等从柳树根系组织中分离得到并鉴定为芽孢杆菌属内的一个新种，命名为韩国芽孢杆菌(bacillus koreensis)。
3.随着基因组学的发展，近期加拿大学者通过对300个芽孢杆菌属的基因组学系统全面比较后，基于csis将芽孢杆菌属进行重新分类。据此，韩国芽孢杆菌在遗传进化分支上独立于芽孢杆菌属之外，目前的分类学中韩国芽孢杆菌正式更名为韩国普里斯特氏菌(priestia koreensis)，并归属于普里斯特氏菌属(priestia sp.)下，ncbi、dsmz等权威机构已采纳新的分类方法。
4.韩国芽孢杆菌次生代谢产物丰富，开发应用潜力大。但是，目前对于韩国芽孢杆菌的开发和应用研究较少。国内专利申请中，仅湖北省生态环境科学研究院(专利号cn202111068096.1)公开了利用韩国芽孢杆菌lqb126制备固定化微生物菌剂，并将其用于治理重金属污染。
5.因此，本行业技术人员需要对韩国芽孢杆菌进行相关研究，进而为韩国芽孢杆菌后续应用提供技术支撑。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，在第一方面，本技术提供了一种韩国芽孢杆菌(bacillus koreensis)，所述韩国芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.24131或cgmcc no.24132。
7.在第二方面，本技术提供了一种细菌培养基，其包括：韩国芽孢杆菌的酶解物，和烟草粉末。
8.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由酶降解韩国芽孢杆菌的菌体获得的。
9.在某些实施方案中，所述酶选自溶菌酶，蛋白酶(例如，蛋白酶k)，或其任意组合。
10.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由溶菌酶和蛋白酶k降解韩国芽孢杆菌的菌液获得的。
11.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌选自第一方面所述的具有保藏号cgmcc no.24131的韩国芽孢杆菌yl-2，具有保藏号cgmccno.24132的韩国芽孢杆菌yla-2，或其任意组合。
12.在某些实施方案中，所述烟草粉末是烟叶粉末。
13.在某些实施方案中，所述烟草粉末是烟梗粉末。
14.在某些实施方案中，所述培养基还包括选自下列的一项或多项：提供营养的物质，无机盐，生长因子，水。
15.在某些实施方案中，所述提供营养的物质选自蛋白胨，牛肉浸膏，糖类，淀粉(例如，可溶性淀粉)，或其任意组合。
16.在某些实施方案中，所述无机盐选自氯化钠，无水氯化钙，或其任意组合。
17.在某些实施方案中，所述培养基包括：韩国芽孢杆菌的酶解物，烟梗粉末，蛋白胨，牛肉浸膏，氯化钠，无水氯化钙，可溶性淀粉和水。
18.在某些实施方案中，所述培养基是液体培养基，固体培养基，或半固体培养基。
19.在某些实施方案中，所述培养基是液体培养基，且包含0.1-10g/l的韩国芽孢杆菌的酶解物，0.1-20g/l的烟梗粉末，1-50g/l的蛋白胨，1-30g/l的牛肉浸膏，1-50g/l的氯化钠，0.1-20g/l的无水氯化钙，1-30g/l的可溶性淀粉，以及水。
20.在某些实施方案中，所述培养基包含0.5-1g/l的韩国芽孢杆菌的酶解物，0.5-1g/l的烟梗粉末，1-20g/l的蛋白胨，1-10g/l的牛肉浸膏，1-15g/l的氯化钠，0.1-5g/l的无水氯化钙，1-10g/l的可溶性淀粉，以及水。
21.在某些实施方案中，所述培养基包含0.5g/l的韩国芽孢杆菌的酶解物，1g/l的烟梗粉末，10g/l的蛋白胨，3g/l的牛肉浸膏，5g/l的氯化钠，0.5g/l的无水氯化钙，2g/l的可溶性淀粉，以及水；或者，
22.所述培养基包含1g/l的韩国芽孢杆菌的酶解物，0.5g/l的烟梗粉末，10g/l的蛋白胨，3g/l的牛肉浸膏，5g/l的氯化钠，0.5g/l的无水氯化钙，2g/l的可溶性淀粉，以及水。
23.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是在韩国芽孢杆菌的菌液中添加溶菌酶和蛋白酶k制备获得的。
24.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由下述方法制备获得的：在韩国芽孢杆菌的菌液中添加10-100mg/l(例如，30-80mg/l)溶菌酶和50-150mg/l(例如，80-100mg/l)蛋白酶k并于水浴酶解，以获得酶解液；任选地，将所述酶解液灭活，并冷冻干燥。
25.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由下述方法制备获得的：培养韩国芽孢杆菌，收集菌液中的菌体并用水重悬至固含量4-15％(例如，4％，6％，8％，10％，12％，14％)，添加10-100mg/l(例如，30-80mg/l)溶菌酶和50-150mg/l(例如，80-100mg/l)蛋白酶k并于水浴酶解，以获得酶解液，灭活酶解液并冷冻干燥至含水率2％-5％(例如，2％，3％，3.2％，4％，5％)。
26.在某些实施方案中，所述烟梗粉末是由氢氧化钠和盐酸依次浸泡烟草的烟梗，干燥后制备成粉末而获得的。
27.在某些实施方案中，所述烟梗粉末是由下述方法制备获得的：0.1-5％(例如，0.5％，1％，2％，3％，4％，5％)氢氧化钠和0.1-5％(例如，0.5％，1％，2％，3％，4％，5％)盐酸依次浸泡烟草的烟梗，干燥至含水率3％-7％(例如，3％，4％，4.8％，5％，5.4％，6％，7％)，然后制成粉末。
28.在某些实施方案中，所述烟梗粉末是由下述方法制备获得的：用1％氢氧化钠浸泡烟草的烟梗，水洗后用1％盐酸浸泡烟草的烟梗，水洗并调整ph至6.5-7.5；干燥至含水率
3％-7％(例如，3％，4％，4.8％，5％，5.4％，6％，7％)，然后制成粉末。
29.在第三方面，本技术提供了第一方面所述的韩国芽孢杆菌或第二方面所述的培养基在培养或发酵细菌中的用途。
30.在某些实施方案中，所述细菌选自乳酸杆菌属，双歧杆菌属，芽孢杆菌属，普里斯特氏菌属，丙酸杆菌属，链球菌属，乳球菌属，片球菌属，肠球菌属，葡萄球菌属，或其任何组合。
31.在某些实施方案中，所述细菌是韩国芽孢杆菌。
32.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌选自具有保藏号cgmccno.24131的韩国芽孢杆菌yl-2，具有保藏号cgmcc no.24132的韩国芽孢杆菌yla-2，或其任意组合。
33.在第四方面，本技术提供了第一方面所述的韩国芽孢杆菌或第二方面所述的培养基在提高细菌产生的酶的活力，或者在延缓所述酶的活力下降的速度，或者在延长所述酶的活力下降的时间中的用途。
34.在某些实施方案中，所述培养基用于提高细菌的培养液或发酵液中酶的活力，或者用于延缓酶的活力下降的速度，或者用于延长酶的活力下降的时间。
35.在某些实施方案中，所述细菌选自乳酸杆菌属，双歧杆菌属，芽孢杆菌属，普里斯特氏菌属，丙酸杆菌属，链球菌属，乳球菌属，片球菌属，肠球菌属，葡萄球菌属，或其任何组合。
36.在某些实施方案中，所述细菌是韩国芽孢杆菌。
37.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌选自具有保藏号cgmccno.24131的韩国芽孢杆菌yl-2，具有保藏号cgmcc no.24132的韩国芽孢杆菌yla-2，或其任意组合。
38.在某些实施方案中，所述酶选自淀粉酶，纤维素酶，果胶酶，或其任意组合。
39.在某些实施方案中，所述酶为淀粉酶，纤维素酶和果胶酶。
40.在第五方面，本技术提供了第二方面所述的培养基的制备方法，所述方法包括：将韩国芽孢杆菌的酶解物，烟梗粉末，提供营养的物质，无机盐，和水混合。
41.在某些实施方案中，将韩国芽孢杆菌的酶解物，烟梗粉末，蛋白胨，牛肉浸膏，氯化钠，无水氯化钙，可溶性淀粉，和水混合。
42.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是在韩国芽孢杆菌的菌液中添加溶菌酶和蛋白酶k制备获得的。
43.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由下述方法制备获得的：在韩国芽孢杆菌的菌液中添加10-100mg/l(例如，30-80mg/l)溶菌酶和50-150mg/l(例如，80-100mg/l)蛋白酶k并于水浴酶解，以获得酶解液；任选地，将所述酶解液灭活，并冷冻干燥。
44.在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由下述方法制备获得的：培养韩国芽孢杆菌，收集菌液中的菌体并用水重悬至固含量4-15％(例如，4％，6％，8％，10％，12％，14％)，添加10-100mg/l(例如，30-80mg/l)溶菌酶和50-150mg/l(例如，80-100mg/l)蛋白酶k并于水浴酶解，以获得酶解液，灭活酶解液并冷冻干燥至含水率2％-5％(例如，2％，3％，3.2％，4％，5％)。
45.在某些实施方案中，所述烟梗粉末是由氢氧化钠和盐酸依次浸泡烟草的烟梗，干燥后制备成粉末而获得的。
46.在某些实施方案中，所述烟梗粉末是由下述方法制备获得的：0.1-5％(例如，
koreensis)，同时归属于普里斯特氏菌属(priestia sp.)下。ncbi、dsmz等权威机构已采纳新的分类方法，但是一些已公开的资料中仍记载的是“韩国普里斯特氏菌”的曾用名“韩国芽孢杆菌”。因此，在文本中，韩国芽孢杆菌(bacillus koreensis)和韩国普里斯特氏菌(priestia koreensis)均代表同一种细菌，可以互换使用。
64.如本文中所使用的，术语“酶活”是指酶的活性，也可称为“酶活力”或“酶活性”，它们都代表相同的含义，可以互换。通常来说，酶活越高，对应的酶催化化学反应的能力就越强。测定酶活的方法是本领域技术人员已知的，可以通过物理方法(例如，旋光法，折光法，比重法)或化学方法(例如，斐林氏法，高锰酸钾法，dns比色法)进行测定。
65.在某些实施方案中，以1分钟水解1微摩尔底物所需的酶量定义为1个酶活力单位u。在某些实施方案中，以1分钟水解1.5％可溶性淀粉，1％羧甲基纤维素钠和1％果胶产生的1μg葡萄糖或半乳糖醛酸所需的酶量定义为1个酶活力单位u。
66.如本文中所使用的，术语“韩国芽孢杆菌的酶解物”是指酶降解韩国芽孢杆菌后获得的产物。在某些实施方案中，所述韩国芽孢杆菌的酶解物是由酶处理韩国芽孢杆菌的菌液获得的产物。
67.如本文中所使用的，术语“烟草(nicotiana tabacum l.)”是茄科烟草属植物，是工业制品烟的原料。烟草在中国南北各省区广为栽培，其是喜温作物，对温度的反应比较敏感，不同的温度条件对烟草的品质、产量影响比较大。
68.如本文中所使用的，术语“烟叶”是指植物烟草的叶片。如本文中所使用的，术语“烟梗”是指烟叶上的粗硬叶脉。
69.如本文中所使用的，术语“发酵”是指借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。如本文中所使用的，术语“发酵液”是指在发酵过程中培养微生物的培养液。
70.发明的有益效果
71.与现有技术相比，本技术的培养基和方法能够显著提高韩国芽孢杆菌的发酵液中酶的活力(例如，淀粉酶，纤维素酶，果胶酶)，尤其是可以显著提高韩国芽孢杆菌发酵液中淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的最高酶活，还能保持更长时间的酶活，并延迟酶活下降的速度。因此，本技术的培养基以及方法能够使得韩国芽孢杆菌高产酶，并提高酶的酶活，在韩国芽孢杆菌的后续应用中(例如，发酵，利用酶降解物质)具有较广泛的前景。
72.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
73.关于生物材料保藏的说明
74.韩国芽孢杆菌yl-2(bacillus koreensis yl-2)已在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)进行保藏，其具有保藏号cgmcc no.24131，且保藏时间为2021年12月20日。
75.韩国芽孢杆菌yla-2(bacillus koreensis yla-2)已在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)进行保藏，其具有保藏号cgmcc no.24132，且保藏时
间为2021年12月20日。
具体实施方式
76.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
77.除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的生物化学、微生物学等常规技术，可参见《酶学方法》(methods in enzymology)系列(学术出版公司)。
78.另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
79.实施例1.
80.取传代复壮后的韩国芽孢杆菌yl-2(cgmcc no.24131)，平板接种于基础发酵培养基(蛋白胨10g/l，牛肉浸膏3g/l，氯化钠5g/l，无水氯化钙0.5g/l，可溶性淀粉2g/l，余量水组成，ph 7.0)中，装瓶量为100/250ml。在37℃，180rpm下培养40h。
81.培养好的菌液10000rpm离心后，倾去上清液得湿菌体，湿菌体添加纯水重悬，调整重悬菌液固含量约5％后，按30mg/l添加溶菌酶，按100mg/l添加蛋白酶k，在40℃水浴酶解6h，后在121℃灭活20min，灭活酶解液-80℃预冻后，经冷冻干燥获得yl-2菌体酶解物(含水率3.2％)备用。
82.取500g烟梗(福建c-2021)使用1％氢氧化钠浸泡18h后用自来水清洗5次，再加入1％盐酸浸泡2h后用自来水清洗至ph6.5，预处理好的烟梗置于80℃烘箱烘干36h(含水率5.4％)，最后将干烟梗使用超微粉碎机粉碎后过100目筛网备用。
83.取制备好的yl-2菌体酶解物和烟梗粉末，按如下配方配置：yl-2菌体酶解物0.5g/l，烟梗粉末1g/l，蛋白胨10g/l，牛肉浸膏3g/l，氯化钠5g/l，无水氯化钙0.5g/l，可溶性淀粉2g/l，余量为水，ph7.0。配制好的发酵培养基按100/250ml的装瓶量分装3瓶，于121℃，灭菌20分钟备用。
84.取传代复壮后的韩国芽孢杆菌yl-2(cgmcc no.24131)，平板挑取3个菌落接种到发酵培养基中，于37℃，180rpm发酵48h。在24、36、48h分别取5ml发酵液于10000rpm，4℃离心去除菌体后使用3，5-二硝基水杨酸(dns)法分别以1.5％可溶性淀粉(ph 5.0)、1％羧甲基纤维素钠(ph 5.0)、1％果胶(ph 9.4)为反应底物在50℃条件下反应测定淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活，以1分钟水解上述底物产生相当于1μg葡萄糖或半乳糖醛酸所需的酶量定义为1个酶活力单位u。
85.对比例1.
86.取传代复壮后的韩国芽孢杆菌yl-2(cgmcc no.24131)，平板挑取3个菌落接种到基础发酵培养基(蛋白胨10g/l，牛肉浸膏3g/l，氯化钠5g/l，无水氯化钙0.5g/l，可溶性淀粉2g/l，余量水组成，ph7.0)中，于37℃，180rpm发酵48h。在24、36、48h分别取5ml发酵液于10000rpm，4℃离心去除菌体后使用dns法测定淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活(具体细节参照实施例1)。
87.实施例2.
88.取传代复壮后的韩国芽孢杆菌yal-2(cgmcc no.24132)，平板接种于基础发酵培养基(蛋白胨10g/l，牛肉浸膏3g/l，氯化钠5g/l，无水氯化钙0.5g/l，可溶性淀粉2g/l，余量水组成，ph 7.0)装瓶量为100/250ml中，在37℃，180rpm下培养60h。
89.培养好的菌液10000rpm离心后，倾去上清液得湿菌体，湿菌体添加纯水重悬调整重悬菌液固含量约8％后，按80mg/l添加溶菌酶、按80mg/l添加蛋白酶k，在40℃水浴酶解4h，后在121℃灭活20min，灭活酶解液-80℃预冻后，经冷冻干燥获得yla-2菌体酶解物(含水率3.5％)备用。
90.取500g烟梗(福建c-2021)使用1％氢氧化钠浸泡24h后用自来水清洗5次，再加入1％盐酸浸泡5h后用自来水清洗至ph7.0，预处理好的烟梗置于80℃烘箱烘干48h(含水率4.8％)，最后将干烟梗使用超微粉碎机粉碎后过80目筛网备用。
91.取制备好的yla-2菌体酶解物和烟梗粉末，按如下配方配制：yla-2菌体酶解物1g/l，烟梗粉末0.5g/l，蛋白胨10g/l，牛肉浸膏3g/l，氯化钠5g/l，无水氯化钙0.5g/l，可溶性淀粉2g/l，余量为水，ph 7.0。配制好的发酵培养基按100/250ml的装瓶量分装3瓶，于121℃，灭菌20分钟备用。
92.取传代复壮后的韩国芽孢杆菌yla-2(cgmcc no.24132)，平板挑取3个菌落接种到发酵培养基中，于37℃，200rpm发酵48h。在24、36、48h分别取5ml发酵液于10000rpm，4℃离心去除菌体后使用dns法测定淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活(具体细节参照实施例1)。
93.对比例2.
94.取传代复壮后的韩国芽孢杆菌yla-2(cgmcc no.24132)，平板挑取3个菌落接种到基础发酵培养基(蛋白胨10g/l，牛肉浸膏3g/l，氯化钠5g/l，无水氯化钙0.5g/l，可溶性淀粉2g/l，余量水组成，ph 7.0)中，于37℃，200rpm发酵48h。在24、36、48h分别取5ml发酵液于10000rpm，4℃离心去除菌体后使用dns法测定淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活(具体细节参照实施例1)。
95.上述实施例1，对比例1，实施例2和对比例2的实验结果如表1所示。对于两株韩国芽孢杆菌yl-2和yla-2，使用本技术的发酵培养基后，淀粉酶最高酶活分别提升了58.9％和24.1％，纤维素酶最高酶活分别提升了52.1％和59.1％，果胶酶最高酶活分别提升了9.8％和12.6％。此外，使用了本技术的发酵培养基的实施例1和2在48h时酶活继续升高(与36h相比)或仍然保持较高水平的酶活(与自身最高酶活相比)，而未使用本技术的发酵培养基的对比例1和2在48h时的酶活已经显著下降(与自身最高酶活相比)。
96.因此，采用本技术的发酵培养基可以显著提高韩国芽孢杆菌发酵液的淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活，还能保持更长时间的酶活，并延迟酶活下降的速度和时间。
97.表1.酶活结果
[0098][0099]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。