一株高产β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌及其应用的制作方法

一株高产
β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌及其应用
技术领域：
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌。


背景技术：

2.β-葡萄糖苷酶(β-d-葡萄糖糖苷水解酶，ec 3.2.1.21)，是一类纤维素酶，能够从含糖化合物中催化水解末端的非还原性β-d-糖苷键，释放出β-d-葡萄糖及相应的单糖、寡糖或复合糖，是一种具有生物催化剂功能的蛋白质。β-葡萄糖苷酶基因广泛存在于自然界各种微生物，包括细菌、放线菌、酵母和丝状真菌等，在一些动物体内也存在。β-葡萄糖苷酶除在降解纤维素方面有着重要作用外，还广泛应用于其他领域，例如食品、造酒、医药和化学工业。
3.β-葡萄糖苷酶作为一类重要的纤维素生物转化用酶，在纤维素糖化水解中起关键性作用，但是微生物所产纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶所占比例不足1％，这使得β-葡萄糖苷酶成为纤维素降解成单糖的关键因素，工业上通过往纤维素酶水解系统中添加β-葡萄糖苷酶来提高纤维素的水解效率。
4.目前的β-葡萄糖苷酶产品主要来源于天然的霉菌。由于天然的菌株产酶性能差，β-葡萄糖苷酶产品不能满足市场的需求。而毕赤酵母是近些年来迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求低，适合于高密度发酵的大规模生产方式，尤其是毕赤酵母分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。因此，本发明通过对本公司一株产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉，通过基因工程手段进行改造，获得一种耐酸性提高的β-葡萄糖苷酶突变体，并且通过构建相应的毕赤酵母工程菌，使其表达，对满足纤维素生物转化工业生产的需求，降低生产成本具有重大意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种耐酸性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。旨在解决β-葡萄糖苷酶在工业生产中酶活力较低、纤维素生物转化应用不理想的问题。
6.本发明具体通过以下技术方案实现：
7.一种耐酸性提高的β-葡萄糖苷酶突变体，该突变体由申请人实验室保藏的黑曲霉菌株(aspergillus niger)pt003经过亚硝基胍诱变的方法筛选获得，将β-葡萄糖苷酶突变体编码基因从诱变菌株中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母gs115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。
8.本发明提供的技术方案之一：是一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体是在seq id no.2所示的pt003野生型β-葡萄糖苷酶的基础上，将其中第60位丝氨酸突变为亮氨酸、第303位缬氨酸突变为丙氨酸所得，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示；
9.本发明还提供上述-葡萄糖苷酶突变体的编码基因；
10.进一步地，所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因具有seq id no.3所示的核苷酸序列。
11.所述β-葡萄糖苷酶突变体的酶学性质如下：
12.(1)最适ph：ph 3.5-5.5酶活稳定，最适作用ph 4.0；
13.(2)最适温度：35℃-55℃酶活稳定，最适作用温度为45℃；
14.(3)耐酸性：该酶在ph 3.5的条件下，24h后酶活力仍存留80％以上。
15.本发明提供的技术方案之三：是包含上述β-葡萄糖苷酶突变体编码基因的重组载体或重组菌株，将上述β-葡萄糖苷酶突变体编码基因重新构建重组载体，并在毕赤酵母中高效表达，得到产高活力β-葡萄糖苷酶的重组菌株，通过发酵、提取等技术获得高活力β-葡萄糖苷酶；
16.进一步地，用于表达所述的β-葡萄糖苷酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母gs115；
17.进一步地，用于表达所述的β-葡萄糖苷酶突变体的表达载体为ppic9k质粒；
18.优选地，所述重组菌株是将seq id no.3所示的β-葡萄糖苷酶突变体编码基因连接表达载体ppic9k，并在毕赤酵母gs115中表达所得。
19.本发明提供的技术方案之四：是技术方案三所述重组载体或重组菌株的应用，特别是在发酵生产seq id no.4所示的β-葡萄糖苷酶突变体中的应用。
20.本发明提供的技术方案之五：是seq id no.4所示β-葡萄糖苷酶突变体的应用，特别是在催化糖苷键水解中的应用，更特别地是在纤维素生物转化产业中的应用。
21.在本发明中采用如下定义：
22.1.氨基酸和dna核酸序列的命名法
23.使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母或单字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
24.2.β-葡萄糖苷酶突变体的标识
25.采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如s60l，表示位置60的氨基酸由野生型的ser替换成leu，位置的编号对应于seq id no.2中野生型β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列编号。在本发明中，g-1表示野生型β-葡萄糖苷酶，g-2表示β-葡萄糖苷酶突变体，信息如下表。
26.β-葡萄糖苷酶氨基酸突变位点氨基酸seqidno.核苷酸seqidno.野生型g-1ser60、val30321突变体g-2ser60leu、val303ala43
27.有益效果：
28.本发明公布了一种全新的β-葡萄糖苷酶突变体，该突变体具有酶活高，耐酸性高的特点，该突变体发酵液酶活可达51000u/ml以上。
29.本发明获得的β-葡萄糖苷酶的最适反应ph在4.0酶活力最高，与野生型pt003的β-葡萄糖苷酶相比，最适反应ph降低了0.5，说明耐酸性提高。
30.本发明获得的β-葡萄糖苷酶在ph 3.5的条件下，24h后酶活力仍存留80％以上，与野生型pt003的β-葡萄糖苷酶相比，耐酸性显著提高。
附图说明：
31.图1最适ph曲线；
32.图2最适温度曲线；
33.图3耐酸性曲线。
具体实施方式：
34.通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。
35.本发明提供一种耐酸性提高β-葡萄糖苷酶突变体，该突变体由申请人实验室保藏的黑曲霉菌株(aspergillus niger)pt003经过亚硝基胍诱变后筛选获得，通过基因测序得到突变的位点为将第60位丝氨酸突变为亮氨酸、第303位的缬氨酸变为丙氨酸。本发明首先获得β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因，将该突变体编码基因与ppic9k载体相连接构建重组质粒，转入相应宿主菌gs115中进行异源表达，发酵获得该突变体相应的β-葡萄糖苷酶。该β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力，适合工业化生产和纤维素生物转化行业。
36.1、实验材料和试剂：
37.实验菌株和载体：基因来源菌株：由本公司保存的黑曲霉pt003；表达宿主菌及载体：gs115和ppic9k均购自美国invitrogen公司；宿主菌：dh5α。
38.主要试剂：dna聚合酶、t4 dna连接酶、dna凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、rna提取试剂盒、pnpg、dnamarker、琼脂糖、氨苄青霉素、iptg、x-gal：均购自上海生工；各种限制性内切酶：购自neb公司。
39.实验仪器：凝胶成像仪(bio-rad)、蛋白电泳仪(bio-rad)、核酸电泳仪(bio-rad)、pcr扩增仪(bio-rad)、高速离心机(eppendorf)。
40.2、本发明采用的β-葡萄糖苷酶活力测定方法：
41.(1)取200μl 0.2m乙酸-乙酸钠缓冲液(ph 5.0)，样品管中加入50μl适当稀释的发酵上清即酶液，空白对照加入50μl缓冲液，50℃水浴预热平衡5min；(2)同时也对pnpg溶液(5.0mm)进行50℃预热平衡；
42.(3)酶液样品的预平衡液中加入250μl预热平衡的pnpg底物溶液，构成500μl酶反应体系，恒温水浴锅中50℃反应10min；
43.(4)立即加入500μl 1.0m na2co3溶液增强显色并终止反应，混合均匀后在室温下静置5min；
44.(5)酶标仪405nm测量对硝基苯酚(p-nitrophenol)吸光值a405。每个样品做三个平行测量。
45.酶活力单位定义：以pnpg为底物，在测定条件下(如非特别说明，测定条件为ph 5.0，50℃)，每分钟水解底物产生1μmol对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需的酶量为一个酶活力单位(u/ml)。即：
46.酶活力单位(u/ml)＝(c
×
n)/t
47.式中，n：原酶液稀释倍数；t：反应时间(min)；c：不同吸光值a405对应于标准曲线
上对硝基苯酚的浓度(μmol/ml)。
48.本发发明及实施例所述野生型β-葡萄糖苷酶g-1编码基因的核苷酸序列为seq id no.1所示：
49.atgggttcagcaacagcttcaaccttgcctccggactttctctggggtttcgcgactgccagctaccagattgaaggcgcagt
50.aaccgaagatggccgtggtccttctatctgggacactttctgcaaaatccctggcaagatagccgggggagccaacggag
51.acgtagcatgcgactcgtaccaccgtacagctgaagacatcgcactgttaaaggaatgcggtgctcaggcttaccgcttctc
52.aatctcatggtcgcgcatcattcccctcggaggccgcaacgaccccatcaacgataagggtgtccaacattatgtcaagttc
53.gtcgacgatcttctagcagcggggatcacaccccttgtgacactgttccactgggatctccccgatgcattagacaagcgct
54.acggtgggctcctcaacaaggaggagttcgttgcagatttcgccaactacgcgcgagtcatgttccgggccctgggctcaa
55.aagtcaagcattggatcaccttcaatgagccgtggtgttccagtgtccttgggtataacgtcggtcagtttgctcccggtcgg
56.acgagtgatcggagcaagagcgcagagggagatagctcgagggagtgctggatcgtggggcacaatatcctcgtggct
57.catggagctgcggtgaagatctaccgagaggagttcaagagtagagatggtggggagatcgggatcacacttaacggag
58.actgggctgagccctgggatcccgagaatccggccgacatcgaagcctgcgaccgcaagatcgaattcgccatttcctgg
59.tttgcagaccccatctatcatggaaggtatccagacagcatgataaagcagcttggcgaccgactccccagctggaccgca
60.gaagacatcgctctcgtccacggcagcaatgacttctatggcatgaaccactactgcgccaactacatcaaagccaaaacc
61.ggcgaagcggatcccaacgatactgccggaaatctggagatcctgctcaagaacaagaagggcgagttcatcggcccag
62.agacacagtctgcatggctgagaccgtatgcacttgggttccggaagctgttgaaatggctaagcgatagatacggtcagc
63.ctaagatctacgttactgagaatgggacgagcttgaagggtgagaatgacttgccggtggaggagctgctgaaggatgaat
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65.gcttggagtttgatggataacttcgaatgggctgaaggttacgaaacccggtttgggtcgacctacgtcgactacgaacatg
66.gccagaagaggatcccgaaggacagtgcgaaacagatcggccagattttcagccagtatatcgagaagaaataa
67.本发发明及实施例所述野生型β-葡萄糖苷酶g-1的氨基酸序列如序列表seq id no.2所示：
68.mgsatastlppdflwgfatasyqiegavtedgrgpsiwdtfckipgkiaggang
69.dvacdsyhrtaediallkecgaqayrfsiswsriiplggrndpindkgvqhyv
70.kfvddllaagitplvtlfhwdlpdaldkryggllnkeefvadfanyarvmfr
71.algskvkhwitfnepwcssvlgynvgqfapgrtsdrsksaegdssrecwivg
72.hnilvahgaavkiyreefksrdggeigitlngdwaepwdpenpadieacdrkie
73.faiswfadpiyhgrypdsmikqlgdrlpswtaedialvhgsndfygmnhyca
74.nyikaktgeadpndtagnleillknkkgefigpetqsawlrpyalgfrkllk
75.wlsdrygqpkiyvtengtslkgendlpveellkdefrtqyfrdyiaamada
76.ytldgvnvraymawslmdnfewaegyetrfgstyvdyehgqkripkdsak
77.qigqifsqyiekk
78.本发发明及实施例所述β-葡萄糖苷酶突变体g-2的编码基因的核苷酸序列为seq id no.3所示：
79.atgggttcagcaacagcttcaaccttgcctccggactttctctggggtttcgcgactgccagctaccagattgaaggcgcagt
80.aaccgaagatggccgtggtccttctatctgggacactttctgcaaaatccctggcaagatagccgggggagccaacggag
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96.gccagaagaggatcccgaaggacagtgcgaaacagatcggccagattttcagccagtatatcgagaagaaataa
97.本发发明及实施例所述β-葡萄糖苷酶突变体g-2的氨基酸序列如序列表seq id no.4所示：
98.mgsatastlppdflwgfatasyqiegavtedgrgpsiwdtfckipgkiaggang
99.dvacdlyhrtaediallkecgaqayrfsiswsriiplggrndpindkgvqhyv
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108.以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
109.实施例1β-葡萄糖苷酶突变体g-2编码基因的获得
110.本公司保藏的一株产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株(aspergillus niger)pt003，经亚硝基胍诱变筛选得到一株具有耐酸β-葡萄糖苷酶活性的菌株，根据野生型β-葡萄糖苷酶g-1编码基因的核苷酸序列设计pcr引物，5'端加入酶切位点xho i，3'端加入酶切位点not i，通过pcr得到突变体g-2的编码基因，经过测序得到其核苷酸序列为seq id no.3，对应的氨基酸序列为seq id no.4。
111.在本发明中，通过野生型和突变体的核苷酸序列的比较，得到突变位点信息如下表。
112.113.实施例2重组载体ppic9k-g-2的构建
114.分别对突变体g-2编码基因(seq id no.3)和质粒ppic9k进行xho i和not i酶切，回收产物，将回收后的g-2编码基因和ppic9k按比例混合，用t4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化产物涂布在lb(含氨苄霉素)固体平板上，33℃倒置培养过夜，挑取单菌落至lb液体培养基，33℃培养，经菌落pcr得到目的序列，测序比对均显示为seq id no.3所示的核苷酸序列，即所得重组载体含有正确的突变基因，将所得重组载体命名为ppic9k-g-2。
115.实施例3重组质粒转化毕赤酵母
116.1.毕赤酵母gs115感受态细胞的制备
117.(1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5ml的ypd培养基，30℃，220r/min振荡过夜；
118.(2)取0.5ml的过夜培养的菌液，接种于50ml新鲜配制的ypd培养基，30℃，220r/min振荡培养，使od
600
值达到1.3-1.5；
119.(3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；
120.(4)弃去上清液，加入50ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；
121.(5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25ml冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；
122.(6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；
123.(3)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1ml冰上预冷的1mol/l的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀；
124.(8)分装100μl/管至无菌ep罐，-30℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。
125.2.线性化质粒的转化
126.将实施例2得到的阳性克隆子进行抽提得到重组质粒ppic9k-g-2，用sal i进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-30℃冻存的)gs115感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。
127.(1)将100μl感受态细胞移出至一新的无菌ep管中，加入10μl线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
128.(2)转化杯置于冰浴中5-10min，保持低温；
129.(3)电穿孔转化电击条件：1500v，200ω，25μf，放电时间5ms左右，一次电击；
130.(4)电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1mol/l的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
131.(5)在超净工作台上无菌操作涂布md培养基(1.34％ ynb；4
×
10-5
％生物素；2％葡萄糖平板)，150μl/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；
132.(6)在md平板上筛选得到两株重组菌，经菌落pcr得到目的序列，测序比对均显示为seq id no.3所示的核苷酸序列，即所得重组菌株含有正确的突变基因，两株重组菌株分别命名为n-01，n-02。
133.实施例4含有重组质粒ppic9k-g-2的酵母菌的诱导表达
134.bmgy培养基配方：1.5％酵母浸出物，2.5％蛋白胨，0.1mol/l ph 6.0磷酸盐缓冲
液，1.34％ ynb，4
×
10-5
％生物素，1％甘油，其余为水。
135.bmmy培养基配方：1.5％酵母浸出物，2.5％蛋白胨，0.1mol/l ph 6.0磷酸盐缓冲液，1.34％ ynb，4
×
10-5
％生物素，0.6％甲醇，其余为水。
136.将重组菌n-01，n-02，以及采用实施例3同样方法以野生型β-葡萄糖苷酶编码基因(seq id no.1所示的核苷酸序列)构建的重组菌株nd-01分别接种于装有30ml bmgy培养基的三角瓶中，30℃，220r/min培养至od
600
为10左右，离心收集菌体，用35ml的bmmy诱导培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养50h，发酵液离心后测定上清中的β-葡萄糖苷酶酶活，结果如下表。
137.菌株β-葡萄糖苷酶酶活(u/ml)nd-018123n-0113519n-0213334
138.实施例5重组菌n-02发酵性能验证
139.以实施例3获得的重组菌n-02为生产菌株。
140.种子罐培养基配方：3.8％甘油，1.4％磷酸二氢铵，0.3％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.6％硫酸钾，0.08％硫酸钙，0.4％氢氧化钾，其余为水，ph 4.5；
141.发酵罐培养基配方：3.8％甘油，1.4％磷酸二氢铵，0.3％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.6％硫酸钾，0.08％硫酸钙，0.4％氢氧化钾，其余为水，ph 4.5；
142.碳源：50％甘油；
143.甲醇：纯甲醇；
144.种子罐培养：培养温度30℃，初始转速200r/min，初始风量2m3/h，通风搅拌培养，ph 4.5，溶氧保持30-40％，当溶氧低于30％时通过增加转速和风量进行控制，湿重增长至85g/l时移种；
145.发酵罐培养：培养温度30℃，初始转速200r/min，初始风量2m3/h，通风搅拌培养，接种量10％，ph 4.5，第0-22h周期，按流速600g/h流加碳源50％甘油，溶氧保持30-40％，当低于30％时通过增加转速和风量进行控制，培养菌体至湿重230g/l；第22h周期后，停补碳源，溶氧反弹至80％以上，保持0.5h；之后按照220g/h的速度流加甲醇，溶氧保持20-30％，培养至总发酵周期为160h发酵结束。
146.采用以上发酵方法进行50l发酵罐放大验证实验，发酵周期160h，其3批次的发酵产酶情况如下表，平均产酶水平为52106u/ml，说明菌株不仅高产酸性β-葡萄糖苷酶而且其发酵性能以及其所产的β-葡萄糖苷酶的酶活均具有一定的稳定性。
147.3批次基因工程菌的发酵产酶情况
148.批次发酵周期(h)发酵活力(u/ml)116051892216052443316051985
149.实施例6β-葡萄糖苷酶的酶学性质
150.(1)最适作用ph
151.以实施例4所得n-02发酵液上清液为突变后β-葡萄糖苷酶样品，以nd-01发酵液上
清液为野生型对照样品，采用本发明采用的β-葡萄糖苷酶活力测定方法，在50℃的条件下，测定不同ph 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0条件下的相对酶活力，以两种酶各自测得的β-葡萄糖苷酶最高酶活为基准。由图1可知，本发明β-葡萄糖苷酶突变体在ph范围3.5-5.0酶活稳定，最适作用ph 4.0，其最适ph较对照降低0.5。上述结果表明，与突变前相比，本发明突变后的β-葡萄糖苷酶在更高的酸性条件下的酶活力更高，其作用ph范围更为宽泛，更适合纤维素生物转化行业。
152.(2)最适作用温度
153.以实施例4所得n-02发酵液上清液为突变后β-葡萄糖苷酶样品，以nd-01发酵液上清液为野生型对照样品，采用本发明采用的β-葡萄糖苷酶活力测定方法，在ph 4.0的条件下，测定不同温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下的酶活力，以两种酶各自测得的β-葡萄糖苷酶最高酶活为基准，计算相对酶活力，结果如图2所示，本发明β-葡萄糖苷酶突变体在35-55℃酶活稳定，最适作用温度为45℃，相较于野生型β-葡萄糖苷酶，最适反应温度没有变化，但是最适温度范围有提高。
154.(3)耐酸性
155.以实施例4所得n-02发酵液上清液为突变后β-葡萄糖苷酶样品，以nd-01发酵液上清液为野生型对照样品，以各自不作处理的β-葡萄糖苷酶酶活为100％基准，两个样品分别在ph 3.5的条件下进行45℃保温处理，每隔2h，在温度50℃、缓冲液ph 5.0的条件下测定酶活力，计算剩余酶活，从图3中可以看出，在24h后，本发明β-葡萄糖苷酶突变体相对活性仍存留80％以上，与野生型β-葡萄糖苷酶相比，突变体β-葡萄糖苷酶的耐酸性有很大提高，说明本发明β-葡萄糖苷酶突变体具有良好的耐酸性。上述结果表明，与突变前相比，耐酸性的提高使突变后的β-葡萄糖苷酶更适合在纤维素生物转化行业中应用。
156.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。