一种具有细胞粘附层的多孔支架及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有细胞粘附层的多孔支架及其制备方法与应用。


背景技术：

2.多细胞球体是最常见的3d细胞培养体系之一，球体可以从一种细胞类型产生，也可以通过共培养方式组合不同种类的细胞。细胞球体具有更接近体内的细胞微环境以及更旺盛的细胞分泌状态，已经应用于肿瘤模型、药物筛选、血管生成、类器官、组织再生和3d打印等多个研究领域。
3.传统的细胞球体培养过程是先获取大量的细胞，然后接种到低粘附表面、水凝胶及支架等载体上，通过细胞的聚集产生球体。该过程需要预先进行细胞2d扩增，操作较为繁琐，且水凝胶、支架类载体无法对细胞球进行有效回收，限制了后续应用研究。
4.申请号为cn202110982360.6的专利文献公开了一种含间充质干细胞球的生物材料支架的制备方法，为了在支架内部创造空间用以培养细胞球体，通过葡聚糖溶液与特定高分子材料的不相容性，制备水包水乳液，水凝胶固化后内部便富含孔洞。该发明申请虽然在水凝胶支架内制造了大孔结构用于细胞培养，但后续细胞无法进行有效回收，且孔洞间的贯通性较差，物质传递不佳，不利于长期培养。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有细胞粘附层的多孔支架及其制备方法，该制备方法利用特定成分水凝胶的可控降解，实现致孔剂的解列流出和粘附层材料、基体材料在后续使用中的可控瓦解。将该多孔支架应用于细胞球体的培养基回收中，多孔支架表面的细胞粘附层在细胞接种后有利于细胞的粘附增殖，发挥细胞扩增的作用；随后使用裂解实际去除粘附层，多孔支架本体的非粘附性抑制细胞附着并促使细胞聚集形成球体；待细胞形成球体后，采用支架裂解液将多孔支架基体材料裂解，进而实现细胞球体的回收。本发明的制备方法制得的多孔支架兼具细胞扩增和细胞球体培养，以及实现细胞微球回收的功能，简化了细胞微球培养过程。
6.一种具有细胞粘附层的多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将水凝胶前驱体、交联剂和缩合剂的水溶液倒入装有致孔剂的模具中至覆盖所述致孔剂，固化脱模得水凝胶；
8.(2)将所得水凝胶浸泡于致孔剂裂解液中使致孔剂分解，用水浸泡清洗得多孔水凝胶；
9.(3)将所述多孔水凝胶浸泡于细胞粘附层修饰液中进行表面修饰，用水浸泡清洗，冻干得所述具有细胞粘附层的多孔支架。
10.上述步骤(1)中，致孔剂先密堆放入模具中，再向模具中倒入水凝胶前驱体、交联剂和缩合剂的水溶液，以保证得到的多孔水凝胶内的孔洞之间相互连通。
11.作为优选，所述水凝胶前驱体为含羧基和双键官能团的聚合物。作为进一步优选，所述聚合物可以是丙烯基团改性海藻酸、丙烯基团改性透明质酸等。更进一步优选为丙烯酰化透明质酸(haac)。
12.作为优选，所述交联剂为胱胺二盐酸盐。
13.作为优选，水凝胶前驱体中羧基与交联剂的摩尔比为(1～10):1。进一步优选为(1～4)：1。更进一步优选为2:1。
14.作为优选，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合物。
15.作为优选，交联剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～4):(1～4)。进一步优选为1:2:2。
16.作为优选，所述致孔剂为交联葡聚糖微球；
17.相应的，所述致孔剂裂解液为右旋糖酐酶溶液。
18.作为进一步优选，右旋糖酐酶溶液中右旋糖酐酶的质量分数为1～10％，溶剂可以是水或pbs缓冲液。作为更进一步优选，右旋糖酐酶溶液中右旋糖酐酶的质量分数为5％。
19.作为进一步优选，所述交联葡聚糖微球的直径为50～500μm。更进一步优选为200～400μm。
20.作为优选，所述细胞粘附层修饰液为巯基和rgd肽修饰的葡聚糖(sh-dex-rgd)溶液。
21.水凝胶前驱体中的羧基用于交联形成凝胶；其中的双键用于与细胞粘附层中的巯基发生麦克加成反应进而使多孔水凝胶修饰细胞粘附层；而细胞粘附层中的rgd肽用于为细胞增殖提供粘附性，使细胞粘附于多孔支架孔洞内壁上进行增殖。
22.作为进一步优选，所述细胞粘附层修饰液中巯基和rgd肽修饰的葡聚糖的质量分数为2～20％。更进一步优选为2～10％。作为进一步优选方案，所述细胞粘附层修饰液中巯基和rgd肽修饰的葡聚糖的质量分数为5％。
23.作为进一步优选，巯基和rgd肽修饰的葡聚糖由羧基化葡聚糖先后与半胱胺和rgd肽偶联得到。
24.具体地，巯基和rgd肽修饰的葡聚糖的制备过程如下：
25.取羧甲基葡聚糖溶于水中，依次加入半胱胺、edc
·
hcl和nhs充分溶解，室温下搅拌反应，反应结束后采用去离子水进行透析反应，透析反应结束后冻干得巯基化葡聚糖；
26.取上述巯基化葡聚糖溶于去离子水中，依次加入rgd肽、edc
·
hcl和nhs充分溶解，室温下搅拌反应，反应结束后采用去离子水进行透析反应，透析反应结束后冻干得所述巯基和rgd肽修饰的葡聚糖。
27.作为优选，步骤(3)中，进行表面修饰时，粘附层修饰液的ph为7～8，浸泡时间大于2h。
28.一种具有细胞粘附层的多孔支架，由上述任一项所述的制备方法制备得到。由上述制备方法制备得到的具有细胞粘附层的多孔支架，具有规则多孔结构及可控瓦解特性，多孔支架表面(外表面及孔洞内表面)均修饰有细胞粘附肽(细胞粘附层中的rgd肽)，细胞粘附肽可通过试剂(粘附层裂解液)调控与支架本体解离。细胞粘附肽解离前，接种的细胞可在多孔支架的孔洞内壁上粘附增殖，粘附肽解离后细胞从多孔支架的孔洞内壁上脱落，
在多孔支架的孔洞内部聚集形成多细胞球体。多孔支架通过二硫键交联而成，当其内部细胞球体形成后，可通过裂解试剂解瓦解支架，收获细胞球体。
29.一种细胞球体的培养及回收方法，包括以下步骤：
30.a.将多孔支架放置于细胞培养孔板中，加入细胞悬液和培养基进行培养；
31.b.待细胞增殖后，向孔板中加入粘附层裂解液，将粘附层分解并使细胞从多孔支架上脱落并在孔洞内聚集形成多细胞球体；
32.c.多细胞球体形成后向孔板中加入支架裂解液，待多孔支架裂解后即可收集得到所述细胞球体；
33.其中，所述多孔支架为上述具有细胞粘附层的多孔支架。
34.上述步骤c中，支架裂解液可在细胞球体成型后的任意时间加入。
35.作为优选，所述粘附层裂解液为右旋糖酐酶溶液；所述粘附层裂解液与上述细胞粘附层相对应。作为进一步优选，所述右旋糖酐酶溶液中右旋糖酐酶的质量分数为1～10％，溶剂为pbs缓冲液。更进一步优选为5％。
36.作为优选，所述支架裂解液为二硫苏糖醇(dtt)、磷酸三(2-氯乙基)酯(tecp)或谷胱甘肽(gsh)的pbs溶液。作为进一步优选，所述支架裂解液的摩尔浓度为1～50mmol/l。作为更进一步优选，所述支架裂解液为摩尔浓度为10mmol/l的tecp的pbs溶液。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
38.本发明的具有细胞粘附层的多孔支架的制备方法，通过对水凝胶前驱体和细胞粘附层材料中反应基团的设计，使细胞粘附层成功修饰于多孔水凝胶的表面(包括孔洞内壁)，形成具有细胞粘附特性的多孔水凝胶支架。该具有细胞粘附层的多孔支架兼具细胞扩增和球体培养回收功能，在细胞培养及组织工程领域有广阔前景；将其应用于细胞培养时，能够在细胞接种时使细胞粘附于多孔支架的孔洞内壁上，待细胞增殖到设定数量后裂解细胞粘附层使细胞在多孔支架的孔洞内形成三维细胞微球，再在细胞微球形成后裂解支架基体，进而实现细胞微球的收集。
附图说明
39.图1为本发明实施例1中具有细胞粘附层的多孔支架的制备工艺流程图；
40.图2为本发明实施例1中制得的具有细胞粘附层的多孔支架的sem图；
41.图3为本发明实施例1中具有细胞粘附层的多孔支架的化学交联及粘附层修饰原理图；
42.图4为本发明实施例2中使用实施例1中制备的多孔支架培养和回收细胞球体的过程示意图；
43.图5为使用本发明实施例2中制得的细胞球体(gfp-huvec细胞)的sem图。
具体实施方式
44.为了使本发明更容易理解，本发明结合下面附图和实施例作进一步详细描述：
45.实施例1
46.1、细胞粘附层修饰材料的制备：
47.1)巯基化葡聚糖的制备：
48.取羧甲基葡聚糖2g溶解于10ml去离子水中；
49.依次加入0.42g半胱胺、1.58g edc
·
hcl和0.94g nhs充分溶解；
50.室温搅拌反应24h；
51.去离子水透析反应2天，冻干得到巯基化葡聚糖。
52.2)rgd接枝葡聚糖的制备：
53.取上述冻干产物巯基化葡聚糖1g溶解于5ml去离子水中；
54.依次加入0.77grgd肽、0.79g edc
·
hcl和0.47g nhs充分溶解；
55.室温搅拌反应24h；
56.去离子水透析反应2天，冻干得到巯基和rgd肽修饰的葡聚糖，即细胞粘附层修饰材料。
57.2、具有细胞粘附层的多孔支架的制备如图1所示：
58.1)取0.4g水凝胶前驱体材料丙烯酰化透明质酸(-cooh为1mmol，聚合物分子量为10-20万，结构单元平均分子量为403，取代度30％)溶于10ml去离子水中，制备成水凝胶前驱体溶液；
59.2)取0.11g胱胺二盐酸盐、0.19g edc
·
hcl和0.12g nhs溶于10ml去离子水中，制备成交联剂溶液；
60.3)将2g致孔剂葡聚糖微球(直径为300-400μm)加入至模具(内部尺寸为5x5x5mm)中；
61.4)均匀混合水凝胶前驱体溶液和交联剂溶液，缓慢加混合后的溶液至模具中至刚好覆盖密堆的葡聚糖微球，4℃静置72h固化；
62.5)将固化好的水凝胶从模具中取出，在5％右旋糖酐酶溶液中浸泡1h，使水凝胶中致孔剂分解；
63.6)流水冲洗使分解后的致孔剂流出水凝胶，待完全除去分解后的致孔剂后，得到非粘附的多孔水凝胶；
64.7)将上述非粘附多孔水凝胶浸泡在上述制得的巯基和rgd接枝的葡聚糖溶液中(溶剂为水，质量分数为5％)，调节ph约为8，浸泡4h；
65.8)浸泡结束后取出多孔水凝胶用流水冲洗，后于-20℃中冷冻8h，最后移入冻干机冻干，即得具有细胞粘附层的多孔支架。
66.上述制得的具有细胞粘附层的多孔支架的扫描电子显微镜照片见图2。由图2可以看出，该多孔支架呈现蜂窝状的多孔结构，孔径较为相同，孔与孔之间互通，孔洞表面有小孔链接。孔径大约在400-500um。
67.上述多孔支架的制备过程中的化学交联反应及细胞粘附层修饰原理见图3。
68.实施例2：细胞的接种培养及球体收获
69.本实施例以内皮细胞(gfp-huvec)为例在实施例1中所制备多孔支架上进行接种培养和细胞球体回收。如图4所示，细胞的接种培养基球体回收过程为：
70.1)将实施例1中制备的多孔支架(5x5x5mm)经辐照灭菌后放于48孔板中；
71.2)向孔板内的多孔支架滴加80μl细胞悬液(gfp-huvec，1x104个/ml)，待细胞悬液完全吸收后在孔板内缓慢加入300μl细胞培养基；
72.3)持续培养7-10天，每2天更换新鲜培养基；
73.4)细胞增殖阶段完成后将多孔支架浸泡入含有5％(质量分数)右旋糖苷酶的pbs溶液中37℃孵育20min，使细胞粘附层分解；
74.5)随后将多孔支架移入细胞培养基中继续培养7天，至多孔支架孔洞内的细胞聚集成球体结构；
75.6)细胞聚集成球体后将多孔支架浸泡入含有10mmol/l tecp的pbs溶液中孵育20min使支架裂解；
76.7)离心并用pbs清洗回收细胞球体。
77.上述回收得到的细胞球体的显微镜照片见图5，由图5可以看出，由上述方法制备的细胞球体大小较为统一，直径约为200um，性状近似为球形，较为密实。