一种PEG

一种peg
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介导的广东虫草原生质体转化方法及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学研究领域，具体涉及一种peg
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介导的广东虫草原生质体转化方法及应用。


背景技术：

2.广东虫草(cordyceps guangdongensis)是一种重要的食药用虫草真菌，具有丰富的活性成分和多种显著的药用功效。该虫草是获国家卫健委批准可作为食品原料安全食用的第二个虫草真菌。目前该虫草已实现规模化生产，进入产业化发展阶段。但其产业化过程中也面临一些菌种退化、子实体产量有限、活性成分含量低、以及品种单一等问题。而用分子生物学手段来深入研究广东虫草的遗传特性、子实体发育机理、以及活性成分合成机制，可以为更好的选育优良品种或改善广东虫草菌种退化、提高子实体产量及活性成分等提供重要的技术支撑。
3.广东虫草目前已完成全基因组测序，获得了高质量的基因组组装序列。但其相关遗传特性、子实体发育机理、以及活性成分合成机制研究仍处于初级阶段。而遗传转化体系的建立是在上述研究中非常关键。目前常见的真菌遗传转化方法主要有根癌农杆菌介导转化(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，atmt)、聚乙二醇(polyethylene glycol，peg)介导原生质体转化、基因枪法(biolistic)和crispr-cas9转化法(clustered regularly interspaced short palindromic repeatscrispr-associated nuclease 9)等。其中根癌农杆菌介导的转化以及peg介导的原生质体转化方法是最常用的两种转化方法。在大型真菌中，目前已建立的转化方法主要是根癌农杆菌介导的转化方法，而peg介导的原生质体转化方法相对较少。而在虫草真菌中，只有少部分虫草建立了遗传转化体系，且主要是根癌农杆菌介导的遗传转化。本发明将以大型食药用虫草——广东虫草为研究对象，提供一种成熟的peg介导的广东虫草原生质体遗传转化体系，为后期深入研究广东虫草遗传特性、促进广东虫草产业化发展奠定重要基础。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种peg
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介导的广东虫草原生质体转化方法。
5.所述一种peg
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介导的广东虫草原生质体转化方法，包括：将制备好的广东虫草原生质体与添加亚精胺溶液的目的基因转化片段混合冰浴后；加入peg
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溶液混匀；加入到培养基中进行原生质体再生培养；再覆盖一层含有抗性标记的培养基，筛选得转化子。
6.优选地，所述亚精胺溶液的终浓度为2-7mmol/l。
7.优选地，所述加入peg
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溶液为分三次加入，每次间隔5-15min。
8.优选地，所述原生质体再生培养时间为1-5天。
9.优选地，所述的广东虫草原生质体、目的基因转化片段、peg
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溶液混合的体积比为2:1:8。
10.优选地，所述的抗性标记为潮霉素，浓度为250μg/ml。
11.优选地，一种peg
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介导的广东虫草原生质体转化方法的具体步骤为：
12.a.dna整合：在100μl目的基因转化dna片段中加入终浓度为5mmol/l的亚精胺，轻轻混匀，冰浴15min；加入200μl广东虫草原生质体，轻轻混匀后，冰浴10min；
13.b.peg
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介导的转化：室温条件下，向广东虫草原生质体及目的基因转化dna片段混合液中加入peg
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溶液(现用现配)，分三次加入，每次间隔10min，加入量为100μl，200μl，500μl；
14.c.原生质体再生培养：向原生质体及目的基因转化dna片段混合液中加入低熔点tb3培养基，混合均匀后倒板，进行原生质体再生培养；
15.d.转化子筛选培养：上述再生培养基培养3天后，继续倒一层含有250μg/ml潮霉素抗性标记的pda培养基，进行转化子筛选培养，长出的转化子转接到新的含有250μg/ml潮霉素抗性标记的pda培养基继续培养，转接三代后获得稳定生长的转化子。
16.优选地，所述的广东虫草原生质体浓度为0.5-1.0
×
106个/ml。
17.优选地，所述的目的基因转化片段浓度为200ng/μl-300ng/μl。
18.优选地，所述目的基因转化dna片段为融合pcr获得含有抗性标记潮霉素基因片段的dna。
19.本发明的第二个目的是提供一种peg
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介导的广东虫草原生质体转化方法在广东虫草品种特性研究、分子生物学研究、遗传育种、以及提高活性成分含量中的应用。
20.具体地，所述的分子生物学研究为基因表达、蛋白定位、基因功能、代谢通路。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
22.本发明首次实现了广东虫草原生质体的转化，建立了一套完整的广东虫草遗传转化方法，成功获得了含有潮霉素抗性标记基因的转化子。该技术可应用于基因表达、蛋白定位、基因功能、代谢通路等分子生物学研究方面。
23.本发明的广东虫草原生质体转化方法操作简单有效，成本相对较低，应用范围广，为广东虫草分子生物学研究奠定了理论与技术基础。
附图说明
24.图1是peg介导的广东虫草原生质体转化及转化子筛选流程图。
25.图2是转化子形态及潮霉素抗性标记(hph)片段pcr检测图。a，广东虫草野生型菌株wt与转化子t1/t2形态图；b，转化子dna水平潮霉素片段检测；c，转化子dna水平潮霉素片段检测；m为d2000 marker，h为h2o，-表示野生型菌株，+表示含有潮霉素的质粒。
具体实施方式
26.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。
27.实施例1
28.1.培养基配制
29.tb3培养基配制：酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，低熔点琼脂20g，加去离子水定容至1l。121℃灭菌20min备用。
30.pda培养基配制：新鲜土豆200g(去皮切成1cm3小块，加1200ml去离子水煮沸后，用4层纱布过滤制成土豆水)，葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1l。121℃灭菌20min备用。
31.2.试剂配制
32.亚精胺溶液配制：配制500mmol/l的亚精胺母液，用0.22μm的无菌滤器过滤备用。
33.peg
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溶液配制(现配现用)：称取0.25g peg
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，加入500μl tris-hcl(10mmol/ml)及500μl cacl2(50mmol/ml)，用0.22μm的无菌滤器过滤备用。
34.3.原生质体准备
35.广东虫草原生质体制备方法参照专利zl201910314473.1，制备好的原生质体浓缩到106个/ml，置于冰上备用。
36.4.dna转化片段准备
37.以潮霉素抗性标记质粒pcambia1300为例，将质粒用kpni内切酶酶切线性化，回收，使其终浓度达到200ng/μl～300ng/μl，备用。
38.5.原生质体介导转化
39.取线性化后回收的质粒片段100μl，加入亚精胺溶液至终浓度5mmol/l，混匀后，冰浴15min，加入200μl广东虫草原生质体，轻轻混匀后，冰浴10min。室温条件下，在广东虫草原生质体与质粒片段混合液中，分三次分别加入100μl、200μl、500μl的25g/v％浓度的peg
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溶液，轻轻混匀后，将混合液全部加入到tb3再生培养基中，倒板，25℃恒温条件下培养。
40.6.转化子筛选
41.tb3再生培养基培养一定天数后，平板中再倒一层含有250μg/ml潮霉素抗性标记的pda培养基，继续培养。待转化子长到上层板后，挑取单个转化子于新的含有250μg/ml潮霉素抗性标记的pda平板中，传代培养三代(图1)，获得稳定的转化子(图2a)。
42.(1)亚精胺最适浓度筛选
43.按照上述转化子筛选方法，将亚精胺的终浓度设置为2mmol/l、5mmol/l、7mmol/l三个不同梯度，添加peg
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溶液间隔时间为10min，添加潮霉素抗性标记上层板间隔时间为3d，比较转化子筛选效率，每个梯度设置三个重复。通过平板菌落计数算出原生质体复苏个数和转化子数，并计算其转化效率(下同)。结果如表1所示，亚精胺的终浓度为5mmol/l时，转化子筛选效率最高。
44.表1不同终浓度亚精胺对peg
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介导的广东虫草原生质体转化效率的影响
[0045][0046]
注：字母a、b分别代表显著性差异程度(p《0.05)
[0047]
(2)添加peg
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溶液最佳间隔时间筛选
[0048]
按照上述转化子筛选方法，将转化过程中加入peg
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的间隔时间设置为5min、10min、15min，亚精胺的终浓度设置为5mmol/l，添加潮霉素抗性标记上层板间隔时间为3d，比较转化子筛选效率，每个时间间隔设置三个重复。结果如表2所示，加入peg
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的间隔时
间为10min时，转化子筛选效率最高。
[0049]
表2添加peg
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溶液不同间隔时间对广东虫草原生质体转化效率的影响
[0050][0051]
注：字母a、b分别代表显著性差异程度(p《0.05)
[0052]
(3)tb3再生培养基添加潮霉素抗性标记上层板最佳间隔时间
[0053]
原生质体复苏长出细胞壁需要一定时间，过早或过晚添加上层潮霉素抗性标记培养基都不利于转化子的筛选。按照上述转化子筛选方法，设置不同时间间隔1d、2d、3d、4d、5d，添加peg
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溶液间隔时间为10min，亚精胺的终浓度设置为5mmol/l，比较转化子筛选效率，每个时间间隔设置3个重复。结果如表3所示，间隔时间为3天转化子筛选效率最高。
[0054]
表3tb3再生培养基添加潮霉素抗性标记上层板不同间隔时间对peg
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介导的广东虫草原生质体转化效率的影响
[0055][0056]
注：字母a、b、c、d分别代表显著性差异程度(p《0.05)
[0057]
7.转化子鉴定
[0058]
提取转化子dna，pcr检测潮霉素抗性基因片段；提取转化子rna，pcr检测潮霉素抗性基因片段的表达情况。dna水平潮霉素基因检测引物：hph-f:gttggcgacctcgtatt和hph-r:gttatgtttatcggcacttt。rna水平潮霉素基因检测引物：hyg-qf：cagcgtctccgacctga和hyg-qr：cagcgtctccgacctga。pcr检测结果确认潮霉素基因插入到转化子中并正确表达(图2b、2c)。
[0059]
本发明的方法可用于基因表达、蛋白定位、基因功能、代谢通路等分子生物学研究方面。