一种水稻OsLOX10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用

本发明属于植物学和生物，具体涉及一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用。

背景技术：

1、脂氧合酶(lipoxygenase，简称lox；ec 1.13.11.12)又称脂肪氧化酶或脂肪氧合酶，是一种含非血红素铁或锰的双加氧酶，在生物体内专一催化具有顺,顺1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸(pufa)的加氧反应。在高等植物体中主要以不饱和脂肪酸中的亚麻酸(linolenic acid；lea)和亚油酸(linoleic acid；la)为反应底物。目前，在许多物种(大豆、玉米、拟南芥、水稻、大麦、番茄、马铃薯及茶树)等中均已发现loxs基因家族，其广泛存在于植物的不同器官和组织中，如植物的根、茎、叶、花、果实和种子等，且具有不同的表达丰度。

2、另一方面，植物在生活史中会面对各种生存压力，包括生物胁迫(病害、虫害)和非生物胁迫(干旱、低温、高温、盐胁迫及机械损伤等)。水稻是我国主要粮食作物，对于水稻的盐碱抗性的研究一直是领域内的热点。现有技术中，具有优良抗盐碱性能的水稻品种通常是通过以下两种方法获得，一方面是通过杂交的方式，另一方面是通过基因编辑技术。针对基因编辑技术，已有通过编辑水稻oscsn5基因、osg2基因、onac103基因等调节水稻的抗盐碱性能的报道。但是通过oslox10基因调节水稻的抗盐碱胁迫性未见相关的报道。

3、技术方案

4、为了获得一种新的具有良好盐碱胁迫抗性的水稻品种，本发明提供了一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其中oslox10基因为如seq no:1所示的基因或其互补基因，本专利中oslox10基因也称为lox10基因。

5、本发明首先提供一种敲除oslox10基因的方法包括：通过选定oslox10敲除靶点，通过pcr扩增以引入靶点，最后利用golden gate克隆法构建该基因的crispr/cas9敲除载体。其中oslox10敲除靶点oslox10-cas9-t1如seq no:2示；oslox10-cas9-t2:如seqno:3所示。

6、oslox10-cas9-t1:ataatggtctctggcgggatcatcgacaccatcacgttttagagctag；

7、oslox10-cas9-t2:attattggtctctaaacccatgcccttgagccgcgacgcttcttggtgcc。

8、本发明进一步包括基于上述方法制备得到的基因敲除载体，通过农杆菌将携带有oslox10-crispr-cas9敲除靶点的载体dna片段整合到水稻愈伤组织细胞中并诱导分化成苗。

9、本发明进一步提供一种过表达oslox10基因的方法包括：以包含目的基因的质粒作为模板进行pcr扩增，然后进行连接转化构建oslox10过表达载体，通过农杆菌将过表达载体整合到水稻愈伤组织细胞中并诱导分化成苗；其中所述pcr扩增中，引物如下：oslox10-oe-f如seq no:5，oslox10-oe-r如seq no:6所示。

10、其中：

11、oslox10-oe-f：ggactcttgaccatggcagcagccgcaggcgag；

12、oslox10-oe-r：ggaaattcgagctggtcacctcagatggaggcgctg。

13、本发明进一步提供一种通过调节lox10在水稻中的表达，影响水稻幼苗对盐碱胁迫的抗性的方法。

14、本发明通过对在光照培养箱将水稻幼苗培养至3叶期，然后用25mm na2co3 ph＝10.0处理5d,然后复水7d并统计存活率。本发明通过实验发现，oslox10基因过表达增强了水稻对盐碱胁迫的抗性。

15、本发明中，为了获得良好的水稻抗盐碱胁迫性，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性为：通过荧光定量分析，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因的相对表达量不小于100倍，优选地，oslox10基因的相对表达量为100～150倍。

16、本发明中，所述碱胁迫抗性是碱性环境下的胁迫抗性，特别是ph值不小于10.0的碱性环境的水稻盐碱胁迫抗性。

17、本发明通过实验发现，oslox10基因过表达增强了水稻幼苗对盐碱胁迫的抗性。对于ph＝10的盐碱胁迫，其第5天过表达植株的活性明显高于空白样和基因敲除植株。复水7天后的植株，oslox10基因过表达植株的存活率明显高于空白样和基因敲除植株。对于过表达苗，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因优选的相对表达量为100～150倍，在此范围内水稻盐碱胁迫抗性更优。

技术实现思路

技术特征：

1.一种水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述oslox10基因为如seq no:1所示的基因或其互补基因。

2.根据权利要求1所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，通过过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性以提高水稻盐碱胁迫抗性，所述oslox10基因编码的蛋白具有如seq no:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性为：通过荧光定量分析，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因的相对表达量不小于100倍。

4.根据权利要求3所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量或表达活性为：通过荧光定量分析，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，oslox10基因的相对表达量为100～150倍。

5.根据权利要求2所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述过表达oslox10基因或提高该基因编码的蛋白在水稻中的表达量的方法包括：以包含目的基因的质粒作为模板进行pcr扩增，并构建oslox10过表达载体，通过农杆菌介导法将目的片段整合到水稻愈伤组织细胞中并诱导分化成苗；其中所述pcr扩增中，引物如下：oslox10-oe-f如seq no:2，oslox10-oe-r如seq no:3所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述水稻为kitaake。

7.根据权利要求1所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述碱胁迫抗性是碱性环境下的胁迫抗性。

8.根据权利要求7所述的水稻oslox10基因在调节水稻盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述碱性环境是ph值不小于10.0的碱性环境。

技术总结
本发明基于水稻通过对OsLOX10基因敲除和过表达制备筛选出相应的植株，并基于由相应植株幼苗进行耐盐碱胁迫实验。OsLOX10过表达增强了水稻幼苗对盐碱胁迫的抗性。对于pH＝10的盐碱胁迫，其第5天过表达植株的存活率明显高于空白样和基因敲除植株。复水7天后的植株，OsLOX10过表达植株的存活率明显高于空白样和基因敲除植株。其中对于过表达植株，以未进行基因编辑的水稻植株为基准，当OsLOX10基因相对表达量为100～150倍时，对应基因编辑植株的存活率最高。本发明为提高水稻的耐盐碱胁迫，特别是提高水稻耐碱性胁迫，提供了一种新的技术方案。

技术研发人员：张建福,王福祥,蔡秋华,何炜,张玲,谢鸿光,魏毅东,林强,郑燕梅,魏林艳
受保护的技术使用者：福建省农业科学院水稻研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15