一种增强型荧光抗体、其制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种增强型荧光抗体、其制备方法及其应用，属于生物检测。

背景技术：

1、免疫荧光染色技术是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，随着免疫治疗的崛起，越来越多肿瘤微环境中的标志物被发现与疾病治疗、进展密切相关。免疫荧光染色及成像分析是研究组织形态和组织原位抗原表达不可或缺的检测技术，广泛应用于临床病理诊断和医学及生物学研究的各个领域。组织切片样本中蕴含着丰富的信息，但是受制于传统单标记免疫组织化学染色方法限制。传统荧光染色的步骤包括脱蜡，水化，封闭及一抗孵育，二抗荧光染色，封片。需要多轮染色，抗体孵育时间较久(大约2-3天)，染色数目较少(3-4色)，而且定量结果的判读往往依赖于肉眼观测，缺乏客观标准。随着蛋白组学的发展，对现代组织学分析提出了更高的要求，例如不同的蛋白共表达和共定位分析、低丰度分子的检测、异质性分析、细胞表型统计乃至复杂组织微环境的描绘等，都需要在同一张组织切片样本上同时检测多种靶标分子。

2、目前有一些染色方法能够解决上述问题。1.tsa酪胺信号放大分子沉淀技术。在hrp酶的催化下，酪胺会被短暂活化，并与相接蛋白分子的酪氨酸残基形成稳定的共价结合；在下一轮的热修复过程中，抗体被洗脱，只有抗原上的荧光信号被保留。可以达到标记7色左右的蛋白标记，有荧光增强效果，不需要考虑一二抗配对。但是存在操作时间长，需要反复清洗&标记，花费时间较久(2-3天)，对技术人员要求高等缺点。2.codex技术。codex设计原理是在每种抗体上标记特异性寡核苷酸“条码标签”(barcode)，成像所需的荧光染料是通过和barcode互补的寡核苷酸序列特异性结合，使得codex突破可见光谱荧光成像通道数量的限制，轻松实现50种或更多蛋白指标的同时检测及分析。但是存在荧光信号较弱，设备、试剂比较昂贵的问题。3.ultivue技术。通过在每种抗体上标记特异性寡核苷酸“条码标签”(barcode)，对抗体标记的探针加长成线型，通过对探针进行扩增后添加特异结合的荧光素实现蛋白的检测。优势是可多色，可反复染色。但是也存在如探针需要一次延伸增长，操作相对复杂，需要荧光素标记互补探针染色的问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种增强型荧光抗体，抗体标记多种目的蛋白，具有信号放大功能，有良好的灵敏度。

2、本发明的第二个目的在于提供一种上述增强型荧光抗体的制备方法，使得多聚赖氨酸能够结合更多的荧光素，而且直接与一抗igg偶联直接孵育，节省了步骤。

3、本发明的第三个目的在于提供一种上述增强型荧光抗体的应用。

4、实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种增强型荧光抗体，增强型荧光抗体包括多聚赖氨酸；多聚赖氨酸上连接有荧光素和igg。

5、进一步地，多聚赖氨酸的分子式为c103h193n31o15·16hcl。

6、进一步地，多聚赖氨酸含有-nh2官能团；荧光素含有-cooh官能团；igg含有-cooh官能团；多聚赖氨酸与荧光素、igg以共价键分别进行连接。

7、进一步地，igg含有fab段肽链。

8、实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种增强型荧光抗体的制备方法，多聚赖氨酸上的-nh2官能团与荧光素上的-cooh、igg上的-cooh分别进行酰胺化反应，使荧光素和igg以共价键结合在多聚赖氨酸上，得到增强型荧光抗体；

9、增强型荧光抗体包括多聚赖氨酸；多聚赖氨酸上连接有荧光素和igg。

10、进一步地，包括：

11、一次孵育步骤：将荧光素溶液和多聚赖氨酸溶液进行混合，于10℃条件下孵育，然后在交联葡聚糖凝胶柱进行过滤，洗脱液为0.1m、ph＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行离心浓缩得到浓缩液，2-8℃冷藏备用；

12、二次孵育步骤：在igg溶液中加入浓缩液，搅拌后孵育，再加入抗原封闭剂，搅拌均匀后得到增强型荧光抗体。

13、进一步地，荧光素溶液中溶剂为浓度0.1m、ph＝7.4的磷酸氢钠溶液，荧光素的浓度为1m。

14、进一步地，多聚赖氨酸溶液中溶剂为浓度0.1m、ph＝7.4的磷酸氢钠溶液，多聚赖氨酸的浓度为0.1g/ml。

15、进一步地，igg溶液为将igg加入ph＝7.4的pbs溶液中，充分搅拌均匀后加入bmps溶液得到；igg的浓度为0.05g/ml。

16、实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种增强型荧光抗体的应用，将增强型荧光抗体用于荧光染色技术；增强型荧光抗体包括多聚赖氨酸；多聚赖氨酸上连接有荧光素和igg。

17、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

18、1、本发明的增强型的荧光抗体是通过在一抗igg上面偶联多聚赖氨酸作为骨架蛋白，直接通过与特异的荧光素结合成为“荧光素-多聚赖氨酸-igg”聚合物来标记目的蛋白；

19、2、本发明的增强型的荧光抗体因为多聚赖氨酸树枝状的结构能够结合更多的荧光素基团与igg,具有信号放大功能，有良好的灵敏度；

20、3、相比传统荧光染色，本发明的增强型的荧光抗体可以标记多色，染色时间大幅缩短(大约1-2天)，解决了传统聚合物空间位阻大、灵敏度不高、非特异性染色的问题；

21、4、本发明的增强型的荧光抗体对于肿瘤免疫，神经科学，代谢等方向的研究提供了很好的工具；

22、5、本发明的增强型的荧光抗体的制备方法使得多聚赖氨酸能够结合更多的荧光素，而且直接与一抗igg偶联直接孵育、洗涤、贴片及拍照，荧光抗体直接标记组织目的抗原，省去了二抗孵育以及洗涤的过程，节省了孵育荧光抗体的步骤。

技术特征：

1.一种增强型荧光抗体，其特征在于，所述增强型荧光抗体包括多聚赖氨酸；所述多聚赖氨酸上连接有荧光素和igg。

2.如权利要求1所述的增强型荧光抗体，其特征在于，所述多聚赖氨酸的分子式为c103h193n31o15·16hcl。

3.如权利要求1所述的增强型荧光抗体，其特征在于，所述多聚赖氨酸含有-nh2官能团；所述荧光素含有-cooh官能团；所述igg含有-cooh官能团；所述多聚赖氨酸与荧光素、igg以共价键分别进行连接。

4.如权利要求1所述的增强型荧光抗体，其特征在于，所述igg含有fab段肽链。

5.一种增强型荧光抗体的制备方法，其特征在于，多聚赖氨酸上的-nh2官能团与荧光素上的-cooh、igg上的-cooh分别进行酰胺化反应，使荧光素和igg以共价键结合在多聚赖氨酸上，得到增强型荧光抗体；

6.如权利要求5所述的增强型荧光抗体的制备方法，其特征在于包括：

7.如权利要求6所述的增强型荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述荧光素溶液中溶剂为浓度0.1m、ph＝7.4的磷酸氢钠溶液，荧光素的浓度为1m。

8.如权利要求6所述的增强型荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸溶液中溶剂为浓度0.1m、ph＝7.4的磷酸氢钠溶液，多聚赖氨酸的浓度为0.1g/ml。

9.如权利要求6所述的增强型荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述ig g溶液为将igg加入ph＝7.4的pbs溶液中，充分搅拌均匀后加入bmps溶液得到；所述igg的浓度为0.05g/ml。

10.一种增强型荧光抗体的应用，其特征在于，将增强型荧光抗体用于荧光染色技术；所述增强型荧光抗体包括多聚赖氨酸；所述多聚赖氨酸上连接有荧光素和igg。

技术总结
本发明公开了一种增强型荧光抗体、其制备方法及其应用，增强型荧光抗体包括多聚赖氨酸；多聚赖氨酸上连接有荧光素和IgG；多聚赖氨酸含有‑NH<subgt;2</subgt;官能团；荧光素含有‑COOH官能团；IgG含有‑COOH官能团；多聚赖氨酸与荧光素、IgG以共价键分别进行连接；增强型荧光抗体的制备方法为以多聚赖氨酸上的‑NH<subgt;2</subgt;官能团与荧光素上的‑COOH、IgG上的‑COOH分别进行酰胺化反应，使荧光素和IgG以共价键结合在多聚赖氨酸上，得到增强型荧光抗体；增强型荧光抗体用于荧光染色技术，抗体标记多种目的蛋白，染色时间大幅缩短。

技术研发人员：公杰,金立强,童云丽,张俊宾,谭卿
受保护的技术使用者：广州睿贝医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11