适用于猫肾细胞F81高密度培养的无血清培养基的制作方法

本发明涉及细胞培养领域，更具体地，本发明涉及一种适用于猫肾细胞f81高密度培养的无血清培养基。

背景技术：

1、随着经济发展的水平提高，人们的生活水平也越来越好，对宠物的需求也逐年增加。猫由于其形象可爱、活泼好动等特点，而作为人类的宠物伴侣被广泛的接受。

2、猫细小病毒病(feline parvovirus disease,fp)，又称之为猫泛白细胞减少症、猫瘟或猫传染性胃肠炎等，是由猫细小病毒(feline panleukopenia virus,fpv)引起的一种急性高度传染病，特征是高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎。fpv在自然条件下能够感染几乎所有的猫科动物，如虎、豹、狮子等，但以体型较小的猫科动物为主。fpv感染后，猫具有明显的临床症状和很高的死亡率，严重流行时可能导致幼猫近乎全部死亡。由fpv引起的猫泛白细胞减少症，在全世界范围内均有传播现象，被多个国家定义为猫最严重的传染病之一。

3、猫细小病毒病主要通过接种疫苗进行预防。目前，传统的猫细小病毒病疫苗分为灭活疫苗和减毒活疫苗，两者均基于细胞基质生产。而传统的工艺为基于贴壁培养的转瓶生产工艺，该工艺需要添加血清、操作复杂、生产规模受限、产品批间差较大，难以满足日益增长的疫苗市场需求。同时，农业部于2021年公告第1708号中明确提出，停止受理转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药gmp验收申请，后续申报新兽药的疫苗厂商需要主动进行技术升级，满足gmp验收申请，而基于细胞基质生产病毒疫苗的主流方向就是无血清全悬浮生产工艺。悬浮培养工艺具有工艺简单、易于规模放大、培养过程中实现在线控制和检测等优势，是目前各大疫苗厂家重点攻关的技术。悬浮培养的关键技术就是获得可以悬浮生长的细胞株和开发配套的无血清培养基。

4、猫细小病毒易感的细胞是猫肾细胞，分离后经过长期传代培养为传代细胞，可以贴壁状态下体外无限增殖。贴壁细胞是否可以悬浮生长，取决细胞本身的特性、驯化的方法和适宜细胞悬浮生长的培养基，针对特定细胞定制化培养基，能够更好的对细胞的营养需求理性设计，使得细胞达到较高的活细胞密度、维持良好的细胞状态和产物高表达。

5、目前，猫肾细胞的培养仍以贴壁培养工艺为主，直接原因是市场上未出现能够支持猫肾细胞f81无血清全悬浮生长的无血清培养基。而已报道的关于猫肾细胞悬浮培养工艺是需要添加血清的，因此，要建立相应的无血清悬浮培养方法，就必须针对猫肾细胞f81生长的特定营养需求，开发一种组分种类少、制备方法简单、且能支持猫肾细胞f81高密度悬浮生长的无血清培养基。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种组分种类少、制备方法简单，能支持猫肾细胞高密度悬浮生长的无血清培养基。

2、本发明第一方面，提供了一种适用于猫肾细胞f81培养的无血清培养基，其特征在于，所述培养基包括糖、氨基酸或其盐、维生素、脂类或其前体、核苷类物质、无机盐、微量元素、ph缓冲剂、水解物和载体蛋白；或者由上述组分组成。

3、在另一优选例中，所述的糖为葡萄糖，其含量为4000-16000mg/l，较佳地为5000-9000mg/l。在另一优选例中，葡萄糖的含量为4500-9000，较佳为4500-5500或5000mg/l。

4、在另一优选例中，所述的氨基酸或其盐包括或由以下组分组成：

5、l-精氨酸：400-1500mg/l

6、l-天冬酰胺：600-2000mg/l

7、l-天冬氨酸：400-1300mg/l

8、l-半胱氨酸：100-400mg/l

9、l-谷氨酸：130-500mg/l

10、l-谷氨酰胺：300-1000mg/l

11、甘氨酸：100-400mg/l

12、l-组氨酸：100-300mg/l

13、l-异亮氨酸：90-500mg/l

14、l-亮氨酸：200-800mg/l

15、l-赖氨酸：300-1000mg/l

16、l-甲硫氨酸：50-300mg/l

17、l-苯丙氨酸：100-300mg/l

18、l-脯氨酸：100-400mg/l

19、l-丝氨酸：250-900mg/l

20、l-苏氨酸：200-1000mg/l

21、l-色氨酸：50-200mg/l

22、l-酪氨酸：100-400mg/l

23、l-丙氨酸：10-50mg/l

24、l-缬氨酸：80-350mg/l。

25、在另一优选例中，所述的氨基酸或其盐包括或由以下组分组成：

26、l-精氨酸：500-1200mg/l

27、l-天冬酰胺：700-1300mg/l

28、l-天冬氨酸：800-900mg/l

29、l-半胱氨酸：100-250mg/l

30、l-谷氨酸：300-500mg/l

31、l-谷氨酰胺：500-600mg/l

32、甘氨酸：100-300mg/l

33、l-组氨酸：200-300mg/l

34、l-异亮氨酸：200-300mg/l

35、l-亮氨酸：200-700mg/l

36、l-赖氨酸：400-600mg/l

37、l-甲硫氨酸：100-250mg/l

38、l-苯丙氨酸：200-300mg/l

39、l-脯氨酸：200-300mg/l

40、l-丝氨酸：350-600mg/l

41、l-苏氨酸：500-600mg/l

42、l-色氨酸：100-200mg/l

43、l-酪氨酸：250-350mg/l

44、l-丙氨酸：10-35mg/l

45、l-缬氨酸：100-300mg/l。

46、在另一优选例中，所述氨基酸或其盐包括或由以下组分组成：

47、l-精氨酸：500-1200mg/l

48、l-天冬酰胺：650-1500mg/l

49、l-天冬氨酸：500-1000mg/l

50、l-半胱氨酸：120-300mg/l

51、l-谷氨酸：200-500mg/l

52、l-谷氨酰胺：500-1000mg/l

53、甘氨酸：150-350mg/l

54、l-组氨酸：150-300mg/l

55、l-异亮氨酸：100-450mg/l

56、l-亮氨酸：230-700mg/l

57、l-赖氨酸：400-800mg/l

58、l-甲硫氨酸：100-300mg/l

59、l-苯丙氨酸：160-280mg/l

60、l-脯氨酸：150-380mg/l

61、l-丝氨酸：300-700mg/l

62、l-苏氨酸：400-900mg/l

63、l-色氨酸：90-180mg/l

64、l-酪氨酸：100-380mg/l

65、l-丙氨酸：10-35mg/l

66、l-缬氨酸：100-300mg/l。

67、在另一优选例中，所述的维生素包括或由以下组分组成：

68、生物素：0.2-1.5mg/l

69、抗坏血酸：30-120mg/l

70、氯化胆碱：40-150mg/l

71、叶酸：5-20mg/l

72、肌醇：40-140mg/l

73、烟酰胺：2-10mg/l

74、d-泛酸钙：2-10mg/l

75、盐酸吡哆醇：2-10mg/l

76、核黄素：0.2-2mg/l

77、硫胺素：3-12mg/l

78、钴胺素：2-10mg/l。

79、在另一优选例中，所述的维生素包括或由以下组分组成：

80、生物素：0.25-1.3mg/l

81、抗坏血酸：50-70mg/l

82、氯化胆碱：55-90mg/l

83、叶酸：8-18mg/l

84、肌醇：85-100mg/l

85、烟酰胺：3-9mg/l

86、d-泛酸钙：2-5mg/l

87、盐酸吡哆醇：6.5-8.5mg/l

88、核黄素：0.5-1.8mg/l

89、硫胺素：5-10mg/l

90、钴胺素：5-9mg/l。

91、在另一优选例中，所述维生素包括或由以下组分组成：

92、生物素：0.3-1.5mg/l

93、抗坏血酸：50-100mg/l

94、氯化胆碱：50-130mg/l

95、叶酸：7-15mg/l

96、肌醇：50-120mg/l

97、烟酰胺：2-8mg/l

98、d-泛酸钙：2-8mg/l

99、盐酸吡哆醇：2-8mg/l

100、核黄素：0.2-1.5mg/l

101、硫胺素：5-10mg/l

102、钴胺素：3-9mg/l。

103、在另一优选例中，所述的脂类或其前体包括或由以下组分组成：

104、胆固醇：1-20mg/l

105、生育酚醋酸酯1-10mg/l，

106、吐温80 1-20mg/l。

107、在另一优选例中，所述的脂类或其前体包括或由以下组分组成：

108、胆固醇：8-12mg/l

109、生育酚醋酸酯4.5-9.5mg/l，

110、吐温80 2-15mg/l。

111、在另一优选例中，所述的脂类或其前体包括或由以下组分组成：

112、胆固醇：2-12mg/l

113、生育酚醋酸酯0.5-10mg/l，

114、吐温80 2-14mg/l

115、在另一优选例中，所述的核苷类物质包括或由以下组分组成：

116、尿苷：0.1-8mg/l

117、胸苷：1-30mg/l

118、次黄嘌呤：10-50mg/l。

119、在另一优选例中，所述的核苷类物质包括或由以下组分组成：

120、尿苷：1-7mg/l

121、胸苷：2-20mg/l

122、次黄嘌呤：25-35mg/l。

123、在另一优选例中，所述的核苷类物质包括或由以下组分组成：

124、尿苷：0.5-6mg/l

125、胸苷：2-20mg/l

126、次黄嘌呤：25-40mg/l。

127、在另一优选例中，所述的无机盐包括或由以下组分组成：

128、二水氯化钙：50-200mg/l

129、氯化钾：120-500mg/l

130、磷酸氢二钠：40-150mg/l

131、氯化钠：2000-8000mg/l

132、一水磷酸二氢钠：90-200mg/l

133、七水硫酸镁：100-400mg/l

134、氯化镁：100-400mg/l。

135、在另一优选例中，所述的无机盐包括或由以下组分组成：

136、二水氯化钙：125-195mg/l

137、氯化钾：300-500mg/l

138、磷酸氢二钠：70-90mg/l

139、氯化钠：3000-5500mg/l

140、一水磷酸二氢钠：100-125mg/l

141、七水硫酸镁：200-250mg/l

142、氯化镁：200-300mg/l。

143、在另一优选例中，所述的无机盐包括或由以下组分组成，单位为mg/l，

144、二水氯化钙：120-200

145、氯化钾：200-500

146、磷酸氢二钠：50-100

147、氯化钠：2000-7000

148、一水磷酸二氢钠：100-150

149、七水硫酸镁：150-300

150、氯化镁：150-350。

151、在另一优选例中，所述的微量元素包括或由以下组分组成：

152、亚硒酸钠：5-100mg/l

153、硫酸亚铁：1-8mg/l

154、硝酸铁：20-150mg/l

155、硫酸铜：10-50mg/l

156、硫酸锌：10-50mg/l。

157、在另一优选例中，所述的微量元素包括或由以下组分组成：

158、亚硒酸钠：20-80mg/l

159、硫酸亚铁：3-6mg/l

160、硝酸铁：20-110mg/l

161、硫酸铜：10-35mg/l

162、硫酸锌：20-50mg/l。

163、在另一优选例中，所述的ph缓冲剂包括或由以下组分组成：

164、4-羟乙基哌嗪乙磺酸：1000-4000mg/l

165、碳酸氢钠：2000-4000mg/l。

166、在另一优选例中，所述的ph缓冲剂包括或由以下组分组成：

167、4-羟乙基哌嗪乙磺酸：1350-1700mg/l

168、碳酸氢钠：2200-3300mg/l。

169、在另一优选例中，所述的ph缓冲剂组成为：

170、4-羟乙基哌嗪乙磺酸：1000-2500mg/l

171、碳酸氢钠：2000-3500mg/l。

172、在另一优选例中，所述的水解物为胰蛋白水解物：2000-3000mg/l。

173、在另一优选例中，所述水解物为胰蛋白水解物，2200-2500mg/l。

174、在另一优选例中，所述的载体蛋白为转铁蛋白：0.5-10mg/l。在另一优选例中，所述的载体蛋白为转铁蛋白，1-5mg/l。在另一优选例中，所述的载体蛋白为转铁蛋白：0.5-5mg/l。

175、在另一优选例中，所述无血清培养基包括或由以下组分组成：l-精氨酸：400-1500mg/l

176、l-天冬酰胺：600-2000mg/ll-天冬氨酸：400-1300mg/ll-半胱氨酸：100-400mg/ll-谷氨酸：130-500mg/l

177、l-谷氨酰胺：300-1000mg/l甘氨酸：100-400mg/l

178、l-组氨酸：100-300mg/l

179、l-异亮氨酸：90-500mg/l

180、l-亮氨酸：200-800mg/l

181、l-赖氨酸：300-1000mg/l

182、l-甲硫氨酸：50-300mg/l

183、l-苯丙氨酸：100-300mg/ll-脯氨酸：100-400mg/l

184、l-丝氨酸：250-900mg/l

185、l-苏氨酸：200-1000mg/l

186、l-色氨酸：50-200mg/l

187、l-酪氨酸：100-400mg/l

188、l-丙氨酸：10-50mg/l

189、l-缬氨酸：80-350mg/l。生物素：0.2-1.5mg/l

190、抗坏血酸：30-120mg/l

191、氯化胆碱：40-150mg/l

192、叶酸：5-20mg/l

193、肌醇：40-140mg/l

194、烟酰胺：2-10mg/l

195、d-泛酸钙：2-10mg/l

196、盐酸吡哆醇：2-10mg/l

197、核黄素：0.2-2mg/l

198、硫胺素：3-12mg/l

199、钴胺素：2-10mg/l；

200、胆固醇：1-20mg/l

201、生育酚醋酸酯1-10mg/l，吐温80 1-20mg/l；

202、尿苷：0.1-8mg/l

203、胸苷：1-30mg/l

204、次黄嘌呤：10-50mg/l；

205、二水氯化钙：50-200mg/l

206、氯化钾：120-500mg/l

207、磷酸氢二钠：40-150mg/l

208、氯化钠：2000-8000mg/l

209、一水磷酸二氢钠：90-200mg/l

210、七水硫酸镁：100-400mg/l

211、氯化镁：100-400mg/l；

212、亚硒酸钠：5-100mg/l

213、硫酸亚铁：1-8mg/l

214、硝酸铁：20-150mg/l

215、硫酸铜：10-50mg/l

216、硫酸锌：10-50mg/l；

217、4-羟乙基哌嗪乙磺酸：1000-4000mg/l；

218、碳酸氢钠：2000-4000mg/l；

219、胰蛋白水解物：2000-3000mg/l；

220、转铁蛋白：0.5-10mg/l。

221、在另一优选例中，所述无血清培养基包括或由以下组分组成：l-精氨酸：500-1200mg/l

222、l-天冬酰胺：700-1300mg/l

223、l-天冬氨酸：800-900mg/l

224、l-半胱氨酸：100-250mg/l

225、l-谷氨酸：300-500mg/l

226、l-谷氨酰胺：500-600mg/l

227、甘氨酸：100-300mg/l

228、l-组氨酸：200-300mg/l

229、l-异亮氨酸：200-300mg/l

230、l-亮氨酸：200-700mg/l

231、l-赖氨酸：400-600mg/l

232、l-甲硫氨酸：100-250mg/ll-苯丙氨酸：200-300mg/ll-脯氨酸：200-300mg/l

233、l-丝氨酸：350-600mg/l

234、l-苏氨酸：500-600mg/l

235、l-色氨酸：100-200mg/l

236、l-酪氨酸：250-350mg/l

237、l-丙氨酸：10-35mg/ll-缬氨酸：100-300mg/l

238、生物素：0.25-1.3mg/l

239、抗坏血酸：50-70mg/l

240、氯化胆碱：55-90mg/l

241、叶酸：8-18mg/l

242、肌醇：85-100mg/l

243、烟酰胺：3-9mg/ld-泛酸钙：2-5mg/l

244、盐酸吡哆醇：6.5-8.5mg/l核黄素：0.5-1.8mg/l

245、硫胺素：5-10mg/l

246、钴胺素：5-9mg/l

247、胆固醇：8-12mg/l

248、生育酚醋酸酯4.5-9.5mg/l，吐温80 2-15mg/l

249、尿苷：1-7mg/l

250、胸苷：2-20mg/l

251、次黄嘌呤：25-35mg/l二水氯化钙：125-195mg/l氯化钾：300-500mg/l

252、磷酸氢二钠：70-90mg/l

253、氯化钠：3000-5500mg/l

254、一水磷酸二氢钠：100-125mg/l

255、七水硫酸镁：200-250mg/l

256、氯化镁：200-300mg/l

257、亚硒酸钠：20-80mg/l

258、硫酸亚铁：3-7mg/l

259、硝酸铁：20-120mg/l

260、硫酸铜：15-35mg/l

261、硫酸锌：20-35mg/l

262、4-羟乙基哌嗪乙磺酸：1350-1700mg/l

263、碳酸氢钠：2200-3300mg/l

264、胰蛋白水解物，2200-2500mg/l。

265、转铁蛋白，1-5mg/l。

266、本发明第二方面，提供一种培养猫肾细胞f81的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的培养基中接种猫肾细胞f81，然后在适合生长的条件下培养猫肾细胞f81一段时间。

267、本发明的无血清培养基，组分种类少、制备方法简单，能够支持猫肾细胞f81高密度悬浮生长。