一种新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统及其分析方法和应用

本发明涉及生物，尤其是涉及一种新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统及其分析方法和应用。

背景技术：

1、溶瘤病毒是一类能选择性地感染并杀死肿瘤细胞而不损伤正常细胞的天然或重组病毒。与传统免疫治疗相比，溶瘤病毒治疗具有靶向性好、不良反应小、杀伤肿瘤途径多、不易产生耐药性等优势。

2、目前针对溶瘤病毒的疗效评估系统主要依据病人的基因检测的结果以及转录组测序得到的数据分析通路的改变来评估病人可能对溶瘤病毒的治疗有效，在肿瘤中ifng-jak-stat通路的缺失可能是溶瘤病毒治疗获益的一个标志物，通过基因检测发现jak2缺失能够预测溶瘤病毒治疗的获益(nguyen等，clinical cancer research,2021)，肿瘤中抗病毒相关通路的缺失也能够作为溶瘤病毒治疗获益的生物标志物，肿瘤细胞中sting的缺失是溶瘤病毒治疗有效的一个标志物(bommareddy pk等，oncoimmunol 2019)，mek通路的缺失也能够反应溶瘤病毒的疗效(bommareddy pk，sci transl med 2018)。除此之外，有特殊类型的溶瘤病毒也有自己特殊的疗效预测标志物，溶瘤病毒m1的肿瘤细胞膜上受体matrixremodeling associated 8(mxra8)能够预测溶瘤病毒m1的疗效。对于溶瘤病毒治疗的反应，主要运用的是在免疫治疗领域方面的研究成果，例如肿瘤浸润t细胞比例，肿瘤中nk细胞密度，以及treg细胞密度，通过免疫组织化学的方法测定肿瘤内cd8+t细胞密度的变化能够反映溶瘤病毒t-vec治疗的黑色素病人的疗效(helen gogas等，j immunother cancer2021)，通过流式细胞术检测外周血中肿瘤抗原特异性t细胞的比例反应溶瘤病毒的治疗疗效(stephen j.russell等，leukemia 2020)。

3、目前的溶瘤病毒类型搭载的武装基因较少，对于肿瘤微环境的改变情况无法很好的描述新型溶瘤病毒对肿瘤微环境的改变，因此无法有效评估新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效，通过检测肿瘤中相关的基因缺失来预测溶瘤病毒治疗效果虽然能够筛选出可能获益的病人，但是这些指标不是疗效的反应，并且仅仅针对溶瘤病毒通过病毒本身的作用对肿瘤细胞进行杀伤，没有反应机体本身的免疫系统的激活和变化，通过免疫组化或流式细胞术检测免疫治疗疗效评估指标，如cd8t细胞浸润，treg细胞比例改变等反应肿瘤微环境变化的指标虽然能够反应机体抗肿瘤免疫的改变，但是上述方法存在通量低，并且仅仅作为免疫治疗疗效反应指标对溶瘤病毒治疗方式没有特异性，也无法反应出溶瘤病毒治疗后机体建立的肿瘤免疫记忆从而预测病人的长期治疗获益。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统及其分析方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一目的，本发明提供了细胞亚群作为标志物在评估新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效中的应用，其特征在于，所述细胞亚群为肿瘤细胞，t淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种。

4、本发明在免疫细胞与非免疫细胞中均发现了与疗效相关的上述细胞亚群的变化，上述细胞亚群可以作为标志物，能够更加全面准确的评估新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效的变化。

5、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述肿瘤细胞包括h19+肿瘤细胞、高细胞周期肿瘤细胞、缺氧肿瘤细胞、ifn反应性肿瘤细胞、低细胞周期肿瘤细胞、ogn+dcnhighcd34high肿瘤细胞中的至少一种；所述t淋巴细胞包括cd4+t细胞、cd8+t细胞、初始t细胞、记忆t细胞、效应t细胞、辅助性t细胞、调节性t细胞中的至少一种。

6、优选地，所述巨噬细胞包括gzmb+巨噬细胞；所述效应t细胞包括cd8+ccl5+效应记忆t细胞；所述记忆t细胞包括ifit3+cd4+中央记忆性t细胞或ifit3+cd8+中央记忆性t细胞；所述辅助性t细胞包括：bhlhe40+cd4+th细胞，所述耗竭t细胞包括：lag+cd8+耗竭t细胞，与mki67+cd8+增殖耗竭t细胞。

7、在本发明中，经过新型溶瘤病毒治疗后的小鼠肿瘤细胞亚群存在差异，ifn反应型肿瘤细胞在治疗后显著增加，这类亚群在功能上有调控机体免疫防御反应，激活淋巴细胞免疫反应，促进淋巴细胞的迁移，并且增加了自身抗原的提呈；

8、经过新型溶瘤病毒治疗后的小鼠髓系细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)亚群存在差异，cd3g+gzmb+巨噬细胞在治疗后显著增加，这类细胞在亚群功能上能够激活t细胞，调节细胞黏附，也能够进行抗原提呈；

9、经过新型溶瘤病毒治疗后的小鼠淋巴细胞亚群存在差异，cd8+ccl5+效应记忆t细胞显著增加，nk细胞比例下调，ifit3+cd4+中央记忆性t细胞比例上升，ifit3+cd8+中央记忆性t细胞比例上升，mki67highcd8+耗竭t细胞减少，cd4/cd8幼稚t细胞减少。

10、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述新型溶瘤病毒包括新型溶瘤病毒vg161，所述新型溶瘤病毒vg161搭载有四个武装基因il-12/il-15/il15rα/pdl1抗原肽。

11、本发明将单细胞测序应用于经新型溶瘤病毒vg161治疗后小鼠结肠癌皮下成瘤肿瘤组织分析中，首先经单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞和非免疫细胞的分布状态、亚型组成，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞和/或非免疫细胞亚型的种类、状态和比例分析，通过go分析和kegg分析明确各细胞亚群的功能，并通过受体配体分析明确各细胞亚群直接的相互作用。

12、作为本发明所述应用的优选实施方式，所示应用包括分析细胞亚群的种类、状态或比例，以及各个细胞亚群的功能进行分析、受体配体。

13、经过试验可知，经过新型溶瘤病毒治疗后的小鼠肿瘤组织中细胞的之间的通讯强度增加，受体配体之间的结合的强度以及受体配体作用类型发生变化。

14、本发明首次采用单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞和非免疫细胞的分布状态、亚型组成，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞非免疫细胞及其细胞亚型的种类、状态和比例分析，得到细胞亚群。

15、第二目的，本发明提供了一种新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统，包括单细胞测序单元、细胞亚型注释单元和细胞亚型差异分析单元以及细胞亚群功能分析单元、受体配体分析单元；

16、所述单细胞测序单元包括单细胞处理模块、文库构建模块或测序模块中的至少一种；

17、所述生物信息分析单元包括细胞分布分析模块或和/细胞亚型分析模块。

18、作为本发明所述新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统的优选实施方式，所述文库构建模块采用scope进行文库构建；所述测序模块采用illumina进行测序。

19、作为本发明所述新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统的优选实施方式，所述细胞分布分析模块采用聚类算法和/或降维算法进行细胞分布分析。优选地，聚类算法包括snn模型。

20、优选地，所述细胞亚型分析模块采用t-sne进行细胞亚型分析。

21、第三目的，本发明提供一种采用上述新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效评估系统的分析方法，包括以下步骤：

22、1)单细胞测序：对样本进行单细胞处理，构建文库并测序；

23、2)生物信息分析：将步骤1)的测序结果进行聚类运算和降维运算，获得细胞的分布状态，和/或进行t-sne分析，获得细胞亚型组成；

24、3)细胞亚型注释；

25、4)细胞亚型差异分析；

26、5)细胞亚群功能分析；

27、6)受体配体分析。

28、本发明采用单细胞测序技术分析样本中免疫细胞和非免疫细胞及其亚型的种类、状态或比例，并分析各个细胞亚群的功能，在溶瘤病毒的疗效评估以及治疗的远期获益的预测具有重要贡献。

29、在一些实施例中，本发明将单细胞测序应用于新型溶瘤病毒治疗的小鼠结直肠癌皮下成瘤组织细胞分析中，首先经单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞和非免疫细胞的分布状态、亚型组成，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞非免疫细胞及其细胞亚型的种类、状态和比例分析，得到细胞亚群，通过差异基因变化分析其细胞亚群的功能以及受体配体分析。

30、在一些实施例中，步骤1)中，所述构建文库采用scope进行，首先利用微流控芯片捕获单细胞，并将数万个具有独特的细胞标签(cell barcode)的磁珠加入到芯片微孔中，确保每孔只含有1个磁珠；细胞裂解后，带有细胞标签和独特分子标签(uniquemolecularindex，umi)的磁珠捕获mrna，为来源于同一细胞的所有mrna标记上相应的细胞标签，同时为每一条mrna标记上独特的umi；收集芯片中的磁珠，将磁珠捕获的mrna反转录为cdna并扩增；将cdna经过片段化、连接接头等步骤构建适用于illumina测序平台的测序文库。

31、作为本发明所述分析方法的优选实施方式，所述步骤4)中，细胞亚型差异分析包括细胞亚型种类差异分析、细胞亚型基因表达差异分析或细胞亚型比例差异分析中的任意一种或至少两种的组合；所述步骤5)中，细胞亚群功能分析包括对go分析或kegg分析中的一种或两种组合；所述步骤6)中，受体配体分析包括常见的细胞通讯相关的受体配体分析。

32、作为本发明所述分析方法的优选实施方式，所述测序采用以下引物序列；

33、序列1：gatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct；

34、序列2：gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct。

35、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

36、1)本发明在免疫细胞与非免疫细胞中均发现了与疗效相关的上述细胞亚群的变化，上述细胞亚群可以作为标志物，能够更加全面准确的评估新型溶瘤病毒的抗肿瘤疗效的变化。

37、2)本发明首次采用单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞和非免疫细胞的分布状态、亚型组成，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞非免疫细胞及其细胞亚型的种类、状态和比例分析，得到细胞亚群，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞和/或非免疫细胞亚型的种类、状态和比例分析，通过go分析和kegg分析明确各细胞亚群的功能，并通过受体配体分析明确各细胞亚群直接的相互作用。

38、3)在本发明中，经过新型溶瘤病毒治疗后的小鼠肿瘤细胞亚群、小鼠髓系细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)亚群、小鼠淋巴细胞亚群存在差异，ifn反应型肿瘤细胞在治疗后显著增加，这类亚群在功能上有调控机体免疫防御反应，激活淋巴细胞免疫反应，促进淋巴细胞的迁移，并且增加了自身抗原的提呈；cd3g+gzmb+巨噬细胞在治疗后显著增加，这类细胞在亚群功能上能够激活t细胞，调节细胞黏附，也能够进行抗原提呈；cd8+ccl5+效应记忆t细胞显著增加，nk细胞比例下调，ifit3+cd4+中央记忆性t细胞比例上升，ifit3+cd8+中央记忆性t细胞比例上升，mki67highcd8+耗竭t细胞减少，cd4/cd8幼稚t细胞减少。