一种可视化荧光检测装置

本技术主张2022年11月16日申请的中国专利申请2022230425157和中国专利申请2022114330904的优先权，上述说明书的全部内容为本技术的参考文献。本技术属于生物，具体涉及一种可视化荧光检测装置。

背景技术：

1、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes，lm)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性短杆菌，在肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品和蔬菜中均可能存在。它能引起人类和动物的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。2000年，世界卫生组织(who)将其列为需要重点监测的食源性致病菌之一。在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

2、目前，国内外对于单核细胞增生李斯特菌的检测主要还是培养法、血清学的检测方法、基于pcr等核酸扩增的检查方法。pcr反应也称之为聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，因其具有特异性强、灵敏度高等特点被广泛应用。在进行pcr反应操作时，需要进行实时荧光检测。而进行实时荧光检测操作时，需要用到对应的实时荧光检测装置。目前市面上常见的实时荧光定量pcr仪主要是通过在pcr反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号值的积累从而对反应产物进行定量分析。但是pcr仪通常体积较大，不够便携，不适合现场即时检测且需要一定的专业操作人员。因此，为了确保食品安全，亟需快速省时、操作简便、准确的方法来检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物f3和b3以及上下游内引物fip和bip，其中fip由f1c和f2组成，bip由b1c和b2组成)，利用一种具有链置换活性的dna聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要pcr仪或荧光定量pcr仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。

4、crispr/cas系统由成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，crispr)和它的辅助蛋白(crispr associatedproteins，cas)构成，是一种细菌适应性免疫系统。crispr/cas12a为v型crispr/cas系统，是一种由crrna引导的具有dna酶活性的蛋白质，可以特异性地结合和切割dsdna或ssdna。此外，被特异性dsdna、ssdna激活后的cas12a还具有非特异性ssdna切割酶活性。crispr/cas12a的精准靶向性，为其应用于核酸检测奠定了基础。cas12a后续激活的ssdna非特异性切割活性为其进行检测信号的放大和可视化读取提供了有利依据。

技术实现思路

1、本实用新型是为了克服现有技术中的实时荧光定量pcr仪不够便携、不适合现场即时检测、操作复杂、费时且成本高的缺陷，提供了一种可视化荧光检测装置。

2、为实现上述发明目的，本实用新型通过以下技术方案实现：

3、一种可视化荧光检测装置，包括：

4、底座，其上设置有用于发出激光的激发灯；

5、发射固定架，其一端盖设在激发灯上且与底座固定连接，其内部设置有发射滤光片，从而使得激发灯发出的激光经过过滤得到发射光；

6、接收固定架，其一端与发射固定架的另一端固定连接，发射固定架与接收固定架的连接处设置有用于容纳反应管的固定孔；所述接收固定架的内部设置有接收滤光片，从而使得发射光与反应管内部产物被发射光激发出的荧光混合后得到的混合光经过过滤得到接收光；所述接收固定架的另一端设置有用于观察反应管内产物颜色变化的观察孔。

7、本实用新型包括一个底座，在底座上设置有用于发出激光的激发灯。还包括发射固定架，其一端盖设在激发灯上且与底座固定连接。发射固定架的内部设置有发射滤光片，从而使得激发灯发出的激光经过过滤得到发射光。通过设计发射固定架与底座连接，形成密闭的光通道，使得激发灯发出的激光光源沿发射固定架的轴向进行传播，有利于减少光束的发散，亮度提高。通过设置发射滤光片，有助于降低激光功率，减少光损伤。同时有效滤除激发灯发出的激光中混杂的其他波长的激光，形成能够激发反应管内产物中的荧光物质发出荧光的发射光。

8、还包括接收固定架，其一端与发射固定架的另一端固定连接。发射固定架与接收固定架的连接处设置有用于容纳反应管的固定孔。有助于反应管的随时放入与取出，样品检测操作方便简单，随用随测，灵活性显著提高。此外，接收固定架的内部设置有接收滤光片，从而使得发射光与反应管内部产物被发射光激发出的荧光混合后得到的混合光经过过滤得到接收光。接收固定架的另一端设置有用于观察反应管内产物颜色变化的观察孔。通过设计接收固定架，使得反应管内的产物中的荧光物质受发射光激发后发射出激发荧光，激发荧光和发射光沿着接收固定架的轴向进行传播，有利于减少光束的发散，亮度提高。通过设置接收滤光片，使得经过接收滤光片处理后只有激发荧光透过，滤除其中混杂的发射光，从而形成能够发出荧光的接收光。有助于操作人员通过观察孔直接肉眼观察即可获得实时荧光检测结果，检测快速高效省时，操作简单，体积小巧便携，成本低。此外，本实用新型的可视化荧光检测装置在荧光检测时是闭盖测样，不会污染环境。同时有效避免样品暴露在环境中，容易导致假阳性。

9、作为优选，所述发射固定架与接收固定架连接处形成的夹角为钝角。

10、本发明人经过多次实验发现，若发射固定架与接收固定架呈直线型连接，通过观察孔观察接收光是否有荧光时极易受到发射光的干扰，影响荧光检测结果；若发射固定架与接收固定架连接处形成的夹角为直角，难以在连接处开设较大尺寸的固定孔且连接处易发生断裂；发射固定架与接收固定架连接处形成的夹角为钝角，有助于增加装置强度，增强装置稳定性，不易断裂。此外，发射固定架与接收固定架固定连接，形成密闭的光通道，使得大量光子集中在一个极小的空间范围内射出，能量密度提高，激光发光亮度显著增强。另外，在荧光检测时是闭盖测样，不会污染环境。有效避免样品暴露在环境中，容易导致假阳性。

11、作为优选，所述接收滤光片滤过的接收光的波长大于发射滤光片滤过的发射光的波长。

12、作为进一步优选，所述接收滤光片滤过的接收光的波长为517nm，所述发射滤光片滤过的发射光的波长为492nm。

13、作为进一步优选，所述激发灯发出的激光光源为led灯、卤素灯、氙气灯中的任意一种或其他常见光源。

14、作为优选，所述发射滤光片位于激发灯上方且靠近底座，所述接收滤光片靠近观察孔一侧。

15、通过设置发射滤光片，有效降低激发灯发出的激光功率，减少光损失。同时有效滤除激发灯发出的激光中混杂的其他波长的激光，形成能够激发反应管内产物中的荧光物质发出荧光的发射光。继而使得发射光光束能够照射到放置在固定孔内的反应管上，进一步激发反应管内产物中的荧光物质发出荧光。通过设置接收滤光片，使得经过接收滤光片处理后只有激发荧光透过，滤除其中混杂的发射光，从而形成能够发出荧光的接收光。有助于操作人员通过观察孔直接肉眼观察即可获得实时荧光检测结果，检测快速高效省时，操作简单。

16、作为优选，所述底座上还设置有用于控制激发灯开闭的开关。

17、作为进一步优选，所述底座上还设置有用于输出稳定电压从而调节光源的光源电路板。

18、一种如上所述的可视化荧光检测装置在检测病原微生物中的应用。

19、一种用于病原微生物的荧光检测方法，包括如下步骤：

20、(s.1)对不同病原微生物菌株的基因组序列，设计靶点特异性的crrna序列，设计的crrna序列如序列表中seq id no:5所示，再构建crrna体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

21、(s.2)对步骤(s.1)中的病原微生物菌株的靶点设计lamp扩增引物，引物序列如序列表中seq id no:1～4所示，对待测核酸样品进行lamp反应，获得lamp扩增产物溶液；

22、(s.3)将步骤(s.1)中纯化后的crrna体外转录产物或合成的crrna分子、步骤(s.2)中获得的lamp扩增产物溶液与cas12a、单链dna探针在crispr反应体系中混合，进行反应，得到crispr反应产物；

23、(s.4)将装有步骤(s.3)中得到的crispr反应产物的反应管置于如上所述的可视化荧光检测装置的固定孔中，打开激发灯通过观察孔进行观察crispr反应产物颜色变化，即可获得荧光检测结果。

24、作为优选，所述步骤(s.3)中的单链dna探针序列如序列表中seq id no:6所示。

25、作为优选，所述步骤(s.3)中的crispr反应体系为20μl体系中，0.05～0.2μmcas12a，0.25～1μm crrna，1～4μm单链dna探针，0.4u重组rna酶抑制剂，1～3μl lamp扩增产物溶液，1×neb buffer 2.1，其中，cas12a与crrna的摩尔比为1:5。

26、作为进一步优选，所述步骤(s.3)中的crispr反应体系为20μl体系中，0.1μmcas12a，0.5μm crrna，2.5μm单链dna探针，0.4u重组rna酶抑制剂，2.0μl lamp扩增产物溶液，1×neb buffer 2.1，其中，cas12a与crrna的摩尔比为1:5。

27、作为优选，所述步骤(s.1)中的病原微生物为单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、dna病毒中的任意一种。

28、因此，本实用新型具有以下有益效果：

29、(1)本实用新型通过设计发射固定架与底座连接且发射固定架与接收固定架连接，形成密闭的光通道，使得激发灯发出的激光光源沿两个固定架的轴向进行传播，有利于减少光束的发散，亮度提高；

30、(2)本实用新型通过设计固定孔，有助于反应管的随时放入与取出，样品检测操作方便简单，随用随测，灵活性显著提高；

31、(3)本实用新型通过设置发射滤光片以及接收滤光片，有效滤除混杂的其他波长的激光。有助于操作人员通过观察孔直接肉眼观察即可获得即时荧光检测结果，检测快速高效省时，操作简单；

32、(4)本实用新型的荧光实时检测装置体积小巧便携，适合现场即时检测，成本低，有利于在生产实践中推广应用。