一种间充质干细胞源外泌体的制备装置的制作方法

1.本实用新型涉及技术领域，特别涉及一种间充质干细胞源外泌体的制备装置。


背景技术：

2.间充质干细胞是目前临床药物开发中最常用的细胞，目前处于临床试验阶段的干细胞治疗产品，大多采用传统培养瓶方式进行2d培养或多层细胞工厂培养，产量有限。尤其在研究进入dna阶段，细胞产能已不能满足临床和商业化的需求，需要不断制备再生产，需要反复的对细胞质量进行批次间等效性验证，由于干细胞产品的批间差异可能较大，这会增加细胞的生产成本和质量的不稳定性风险。
3.干细胞在正常培养条件下分泌的外泌体数量极其有限，不仅受限于细胞本身的状态，也受限于培养环境。往往收获的培养基中外泌体含量很低，使得后续的外泌体分离步骤效率很低。
4.另外，外泌体的大小为纳米级别，目前外泌体的提取最常用的方法为离心法，然而离心设备贵重、耗材成本高、离心时间长、操作精度要求太高，目前没有一种低成本、操作简便、高特异性、高回收率的外泌体提取方法。
5.因此，本实用新型进行了间充质干细胞源外泌体的制备装置的研究，以解决现有技术中存在的问题。


技术实现要素：

6.本实用新型目的是：提供一种间充质干细胞源外泌体的制备装置，以解决现有技术中间充质干细胞培养产量低、外泌体分泌量低以及外泌体提取不便等问题。
7.本实用新型的技术方案是：一种间充质干细胞源外泌体的制备装置，包括：
8.液控部件，其包括连接有第一管道的培养基瓶，所述第一管道上设置有单向阀；
9.培养部件，其包括连接有第二管道的培养瓶，所述培养瓶上设置有混合装置，所述培养瓶还与第一管道远离培养基瓶的一端连接；
10.收集部件，其包括设置有过滤管的收集瓶，所述过滤管内设置有过滤膜，所述过滤管的上端与第二管道远离培养瓶的一端连接；
11.其中，所述过滤膜沿过滤管轴向倾斜设置，倾斜角度为20
°‑
60
°
，且设置有多个为z字型排列的过滤膜。
12.优选的，所述培养基瓶上设置有第一气口；所述过滤管上设置有第二气口。
13.优选的，所述混合装置为搅拌器，搅拌形成湍流，且搅拌转速为20-100r/m i n。
14.优选的，所述混合装置为造波器，对培养瓶内液体形成波浪。
15.优选的，所述过滤膜的过滤尺寸为30nm、50nm、100nm、0.22μm、1μm，且可组合使用。
16.使用本装置制备间充质干细胞源外泌体的方法，包括以下步骤：
17.s1、培养基瓶中置入完全培养基；
18.s2、将间充质干细胞和细胞微载体接种于培养瓶中，并使用混合装置均质混合及
培养；
19.s3、打开单向阀，使得培养基瓶中的完全培养基通过第一管道补给到培养瓶中，并使得培养瓶中的液体通过第二管道及过滤管进入收集瓶；
20.s4、取出滤膜，并对滤膜上的过滤的外泌体进行收集。
21.优选的，步骤s2中所述接种于培养瓶中的间充质干细胞和胶原微球的比例为5-10:1，培养瓶中的培养时间为72h。
22.优选的，所述细胞微载体为plga和胶原微球溶液，所述plga为75％乳酸和25％羟基乙酸组成。
23.与现有技术相比，本实用新型的优点是：
24.(1)将干细胞包被到微载体上可实现干细胞的3维培养，相同条件下，使用细胞微载体进行细胞培养的间充质干细胞数量是使用传统培养法培养间充质干细胞数量的10-100倍；
25.(2)培养环境中通过涡轮增加湍流或造波器进行造波，给干细胞培养提供一定的培养的压力，促进干细胞对外泌体的释放，相同条件下，外泌体数量是不使用湍流处理或造波处理的相同数量间充质干细胞产出的外泌体数量的10倍以上；
26.(3)收集部件中的1μm滤膜用于过滤培养基中残存的细胞碎片和杂质，采用30nm、50nm、100nm、0.22μm滤膜可进行不同组合以收集不同尺寸的间充质干细胞外泌体，操作简单，成本低且回收率高；
27.(4)收集部件中滤膜过滤后，收集瓶中的培养基可用于后续研究或继续用于此装置，重复利用也可进一步保证细胞培养的一致性。
附图说明
28.下面结合附图及实施例对本实用新型作进一步描述：
29.图1为本实用新型所述间充质干细胞源外泌体的制备装置结构示意图；
30.图2为本实用新型不同条件下间充质干细胞来源的外泌体产量的柱状图；
31.图3为本发明所述的间充质干细胞制备的示意图；
32.图4为本发明所述的间充质干细胞在细胞载体上生长时的示意图。
33.其中：培养基瓶1，第一管道11，单向阀12，第一气口13，培养瓶2，第二管道21，混合装置22，收集瓶3，过滤管31，过滤膜311，第二气口32。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例，对本实用新型的内容做进一步的详细说明：
35.如图1～4所示，一种间充质干细胞源外泌体的制备装置，包括：
36.液控部件，其包括连接有第一管道的培养基瓶1，第一管道11可以为无菌软管，第一管道11上设置有单向阀12，培养基瓶1上还设置有第一气口13。
37.培养部件，其包括连接有第二管道21的培养瓶2，第二管道21可以为无菌软管，培养瓶2上设置有混合装置22，培养瓶2还与第一管道11远离培养基瓶1的一端连接；混合装置22可以是设置在培养瓶2内部的均质搅拌器，以转速为20-100r/m i n的搅拌形成湍流，也可以是设置在培养瓶2外部的造波器，对培养瓶2内液体形成波浪。混合装置22的作用是对
细胞培养提供一定的压力，促进干细胞对外泌体的释放(如图2所示，为采用纳米粒子追踪分析(nta)方法，在不同条件下外泌体产量柱状图)。
38.收集部件，其包括设置有过滤管的收集瓶3，过滤管31内设置有过滤膜311，过滤管31的上端与第二管道21远离培养瓶2的一端连接，过滤管31上还设置有第二气口32；过滤膜311沿过滤管31轴向倾斜设置，倾斜角度为20
°‑
60
°
，且为z字型排列的多个。根据过滤的外泌体选择合适的倾斜角度，倾角过小时，会影响培养基中外泌体的过滤效率；倾角过大时，会使得培养基垂直经过滤膜311，使得被拦截的外泌体在过滤膜311表面不断积累，造成过滤膜311上滤孔的堵塞，降低后续过滤效率；在过滤截留的同时也会通过滤液流冲走上端过滤膜311表面截留的外泌体，起到一定切向流过滤效果，使得外泌体不断的在多个不同尺寸滤膜之间富集。过滤膜311的过滤尺寸为30nm、50nm、100nm、0.22μm、1μm，且可组合使用。按过滤尺寸由大至小向下排列设置，一般1μm滤膜置于最上端，用于过滤培养基中残存的细胞碎片和杂质。
39.滤膜过滤后，收集瓶3中的培养基可用于后续研究或继续用于此装置中，重复利用也可进一步保证细胞培养的一致性，同时降低培养成本。
40.本实施例中，间充质干细胞的培养及其外泌体的培养方法为：
41.s1、培养基瓶1中置入完全培养基；
42.s2、将间充质干细胞和细胞微载体接种于培养瓶2中，并使用混合装置22均质混合及培养；
43.s3、打开单向阀12，使得培养基瓶1中的完全培养基通过第一管道11补给到培养瓶2中，并使得培养瓶2中的液体通过第二管道21及过滤管31进入收集瓶3；
44.s4、取出滤膜，并对滤膜上的过滤的外泌体进行收集。
45.其中，细胞微载体为plga和胶原微球溶液，plga为75％乳酸和25％羟基乙酸组成；接种于培养瓶2中的间充质干细胞和胶原微球的比例为5-10:1，培养瓶2中的培养时间为72h。
46.需要说明的是，本实施例中，plga和胶原微球溶液的制备方法为：
47.(1)将二氯甲烷用氢化钙加热回流干燥3小时，除去其中的水分；
48.(2)将20mg bsa(牛血清白蛋白)和20mg蔗糖溶于800μl超纯水中；
49.(3)将0.2g plga 20k(乳酸：羟基乙酸＝25:75)加入到4ml上述干燥的二氯甲烷中，不断搅拌，使其完全溶解。用一次性滴管吸取span80向上述溶液中滴加1滴，混匀。向溶液中滴加0.1ml的2-甲基戊烷，并不断搅拌；将(2)中的水相溶液加入到此步骤的溶液中进行搅拌乳化，搅拌速率为500rpm。
50.(4)配制1wt％的pva(mw＝31000)水溶液28.5ml。用一次性滴管吸取tween80向pva水溶液中滴加5滴，混匀；
51.(5)用注射器取步骤3中的油相溶液逐滴滴加入步骤4的pva水溶液中，并不断搅拌过夜，直至其中的二氯甲烷挥发完全，搅拌速率为500rpm；
52.(6)将步骤3中的溶液3500rpm离心5min，然后同样转速和时间用去离子水清洗3次。除去上层液体，将产物置于真空干燥箱室温干燥24h。经上述处理程序后，就获得了表面多孔的plga微球。粒径分布为258
±
20.3μm；
53.(7)将traut’s试剂加入到浓度为10mg/ml的胶原溶液中，在室温搅拌下反应1h；
54.(8)向步骤7的反应液中加入步骤6得到的微球，得到plga微球悬浮液；
55.(9)室温下反应6-12h；3500rpm离心，pbs缓冲溶液洗涤三次，透析，冻干得到表面固定胶原的plga-胶原微球。
56.脐带间充质干细胞原代分离的方法为：
57.(1)组织碎块放进准备好的干净的10cm培养皿，碎块之间相距约0.5cm,将培养皿倒置过来后，放在细胞培养箱中30-60m i n(为了使组织与培养皿贴紧，便于细胞爬出)；
58.(2)以最缓慢的速度自培养皿边缘加入3-5ml完全培养基，加盖并放入30℃细胞培养箱；
59.(3)原代培养的前3天不宜触碰这此结养皿，以免织织块漂起。第4天或第5天，将皿取出，在超净台上用电动移液枪吸出培养液，缓缓加入完全培养基，重新放入培养箱中继续培养；
60.(4)从培养第7天开始，要求至少每隔一天取出培养皿在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态(p0)。原代间充质干细胞一般只生长在组织块周围，当发现局部细胞密度超过80％时即可传代。
61.上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围。对于本领域技术人员而言，显然本实用新型不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本实用新型的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本实用新型，因此无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本实用新型的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本实用新型内。