VEGFA结合分子的制作方法

本公开涉及分子生物学领域，更具体地涉及抗原结合分子技术。本发明还涉及医学治疗和预防的方法。

背景技术：

0、背景

1、抗vegf疗法可用于治疗多种病症，特别是在肿瘤学和眼科领域(1-3)。由于其小尺寸和模块化，开发针对vegf靶点的人源化和稳定的抗体结构域是可取的。眼科应用需要小尺寸和高稳定性，因为这可以使药物实现局部递送(4，5)。模块化，即结构域抗体自主折叠并与其他结构域抗体或其他蛋白质融合而不损害其完整的能力，对于多价和多特异性分子的开发是非常需要的。事实上，它通过将抗体结构域串联融合至单克隆抗体或任何其他融合蛋白，简化了提高效价和特异性的过程(6-8)。

2、概括

3、在第一方面，本公开提供了一种抗原结合分子，可以是分离的，其结合vegfa，所述抗原结合分子包含具有以下cdr的单域抗体序列:

4、cdr1具有seq id no:13的氨基酸序列cdr2具有seq id no:14的氨基酸序列cdr3具有seq id no:15的氨基酸序列。

5、在一些实施方案中，抗原结合分子包含与seq id no:16的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

6、在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有以下fr的单域抗体序列:

7、fr1具有氨基酸序列seq id no:9，fr2具有氨基酸序列seq id no:10，fr3具有氨基酸序列seq id no:11，fr4具有氨基酸序列seq id no:12。

8、在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有以下cdr的单域抗体序列:

9、cdr1具有seq id no:2的氨基酸序列，cdr2具有seq id no:3的氨基酸序列，cdr3具有seq id no:4的氨基酸序列。

10、在一些实施方案中，抗原结合分子包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

11、在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有以下cdr的单域抗体序列:

12、cdr1具有seq id no:6的氨基酸序列，cdr2具有seq id no:7的氨基酸序列，cdr3具有seq id no:8的氨基酸序列。

13、在一些实施方案中，抗原结合分子包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

14、在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa和vegfr之间的相互作用。

15、在一些实施方案中，抗原结合分子是多特异性抗原结合分子，其还包含对除vegfa之外的靶抗原有特异性的抗原结合结构域。

16、本公开还提供了包含本文所述的抗原结合分子的嵌合抗原受体(car)。

17、本公开还提供了编码本文所述的抗原结合分子或car的核酸，任选地，该核酸是分离的。

18、本公开内容还提供了包含本文所述的核酸的表达载体。

19、本公开还提供了包含本文所述的抗原结合分子、car、核酸或表达载体的细胞。

20、本公开还提供了用于产生结合vegfa的抗原结合分子的方法，包括在适合于细胞表达抗原结合分子的条件下培养本文所述的细胞。

21、本公开还提供了本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物，其用于医学治疗或预防的方法中。

22、本公开还提供了本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物，其用于治疗或预防病理学上涉及vegfa/vegfr介导的信号传导的疾病的方法中。

23、本公开还提供了本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物在制备用于治疗或预防病理学上涉及vegfa/vegfr介导的信号传导的疾病的药物中的用途。

24、本公开还提供了治疗或预防病理学上涉及vegfa/vegfr介导的信号传导的疾病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物。

25、在一些实施方案中，所述疾病选自:以病理性血管生成为特征的疾病、癌症、表达vegfa的癌症、表达vegfr的癌症、眼部疾病、视网膜病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、近视性脉络膜新生血管形成、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、中心性浆液性视网膜病、眼肿瘤、角膜新生血管、炎症性疾病、自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、多发性硬化症、败血症、运动神经元疾病和肌萎缩侧索硬化症。

26、本公开内容还提供了一种体外复合物，任选的，该复合物是分离的，其包含与vegfa结合的根据本文所述的抗原结合分子。

27、本公开还提供了用于检测样品中的vegfa的方法，包括使含有或疑似含有vegfa的样品与本文所述的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与vegfa的复合物的形成。

28、本公开还提供了本文所述的抗原结合分子在用于检测、定位或成像vegfa或包含或表达vegfa的细胞的方法中的用途。

29、本公开还提供了选择或分层用于用vegfa靶向剂治疗的受试者的方法，该方法包括在体外使来自受试者的样品与本文所述的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与vegfa的复合物的形成。

30、本公开还提供了本文所述的抗原结合分子作为体外或体内诊断剂或预后剂的用途。

31、本公开还提供了本文所述的抗原结合分子在用于检测、定位或成像以vegfa的表达为特征的疾病或病症的方法中的用途。

32、描述

33、我们在此描述了以高亲和力靶向人和鼠vegfa的人源化、稳定和自制的vh结构域抗体的生成，这些抗体能够高效阻断vegf-vegfr相互作用。这些vegf结合分子可用作生成多价和多特异性分子的构件，如两个vh结构域抗体串联构建的二价抗vegfa分子所例证的。

34、vegfa

35、血管内皮生长因子a(vegfa)是一种被标识为uniprot p15692的蛋白质。人vegfa基因编码的mrna的选择性剪接产生四种主要vegfa亚型:vegf206(seq id no:17)、vegf189(seq id no:18)、vegf165(seq id no:19)和vegf121(seq id no:20)。在处理去除n端26个氨基酸信号肽(seq id no:25)后，vegf206、vegf189、vegf165和vegf121分别包含seq idno:21至24中所示的氨基酸序列。vegf165似乎是主要的vegfa亚型。

36、vegfa是一种生长因子，例如在holme and zachary genome biol.(2005)6(2):209，以及claesson-welsh and welsh，j intern med.(2013)273(2):114-27中所描述的，这两篇文献均通过引用整体并入本文。

37、血管内皮生长因子(vegf)是具有保守的受体结合胱氨酸结结构的分泌性多肽家族。vegfa单体通过链间二硫键缔合形成同二聚体。vegfa通过内皮细胞表达的同源受体激酶家族发挥作用，刺激血管形成。

38、vegfa在正常血管发育以及涉及血管异常生长的疾病(例如癌症)中具有重要作用。vegfa刺激源自动脉、静脉和淋巴系统的血管内皮细胞的生长，并在多种体内模型中诱导血管生成(即形成薄壁内皮衬里结构)，从而诱导微血管通透性快速升高。

39、在本说明书中，“vegfa”是指来自任何物种的vegfa，并且包括来自任何物种的亚型、片段、变体或同源物。在一些实施方案中，vegfa是来自哺乳动物(例如兽类、胎盘类、上皮类、前兽类、古猿、灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人))的vegfa。在一些实施方案中，vegfa是人或小鼠vegfa。

40、如本文所用，给定参考蛋白的亚型、片段、变体或同源物可表征为与参考蛋白的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一。“片段”通常指参考蛋白质的一部分。“变体”一般是指具有相对于参考蛋白质的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其他修饰的氨基酸序列的蛋白质，但与参考蛋白质的氨基酸序列保留相当程度的序列同一性(例如与参考蛋白有至少60％的序列同一性)。

41、“亚型”通常是指由与参考蛋白的物种相同的物种表达的参考蛋白的变体。“同源物”通常指与参考蛋白的物种相比由不同物种产生的参考蛋白的变体。同源物包括直系同源物。

42、vegfa的亚型包括vegf206(uniprot p15692-1)、vegf189(uniprot p15692-2)、vegf165(uniprot p15692-4)和vegf121(uniprot p15692-9)。vegfa的亚型还包括vegf183(uniprot p15692-3)、vegf148(uniprot p15692-5)、vegf145(uniprot p15692-6)、vegf165b(uniprot p15692-8)、vegf111(uniprot p15692-10)、l-vegf165(uniprotp1569)2-11)、l-vegf121(uniprot p15692-12)、l-vegf189(uniprot p15692-13)、l-vegf206(uniprot p15692-14)、vegfa亚型15(uniprot p15692-15)、vegfa亚型16(uniprotp15692-16)、vegfa亚型17(uniprot p15692-17)和vegfa亚型18(uniprot p15692-18)。

43、vegfa亚型、片段、变体或同源物可任选地表征为与来自选定物种的未成熟或成熟的vegfa亚型的氨基酸序列具有至少70％、优选自80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，例如人类。

44、在一些实施方案中，vegfa是人vegfa。在一些实施方案中，vegfa是小鼠vegfa。

45、亚型、片段、变体或同源物可以任选地是功能亚型、片段、变体或同源物，例如功能亚型、片段、变体或同源物，例如，具有参考vegfa(例如人vegf165)的功能特性或活性，如通过针对功能特性或活性的合适测定法进行分析所确定的。例如，vegfa的亚型、片段、变体或同源物可以表现出与vegf受体(例如vegfr1、vegfr2和/或vegfr3)的关联。

46、在一些实施方案中，vegfa包含与seq id no:17、18、19或20具有至少70％，优选自80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或由上述序列组成。

47、在一些实施方案中，vegfa或其片段包含与seq id no:21、22、23或24具有至少70％，优选自80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或由上述序列组成。

48、vegf通过结合vegf受体(vegfr)vegfr1(aah39007.1 gl:24660372)、vegfr2(p35968.2 gl:9087218)和vegfr3(aaa85215.1 gl:1150991)发挥其生物学作用。

49、每个受体都具有vegf的胞外结合域、跨膜序列和胞内酪氨酸激酶部分。vegf与细胞外受体结构域结合使受体二聚化并导致细胞内酪氨酸激酶部分磷酸化。vegfa已被证明主要通过vegfr1和vegfr2发挥其生物学作用。

50、在本说明书中，“vegfrt”，“vegfr2”和“vegfr3”分别指来自任何物种的vegfr1/vegfr2/vegfr3，并且包括来自任何物种的亚型、片段、变体或同源物。在一些实施方案中，vegfr1/vegfr2/vegfr3来自哺乳动物(例如兽类、胎盘类、上皮类、前兽类、古猿、灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人))。在一些实施方案中，vegfr1/vegfr2/vegfr3是人或小鼠vegfr1/vegfr2/vegfr3。

51、vegfr1/vegfr2/vegfr3的亚型、片段、变体或同源物可以任选地表征为与来自给定物种(例如：人)的相关分子的未成熟或未成熟或未成熟亚型的氨基酸序列具有至少70％，优选自80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。成熟亚型，例如人类。

52、本文中，“vegfa/vegfr介导的信号传导”是指通过vegfa与vegf受体的结合引发的信号传导。“信号传导”是指信号转导和其他控制细胞活动的细胞过程。

53、vegfa/vegfr介导的信号传导被描述为，例如记载于geindreau等，int j molsci.(2021)22(9):4871，其全部内容通过引用并入本文。vegfa/vegfr介导的信号传导在细胞内通过pi3k/akt、mapk/erk和plc-y途径以及scr和fak进行，促进细胞存活、增殖、细胞骨架重排，并影响血管通透性、血管舒张和促进血管生成的变化。

54、抗原结合分子

55、本公开提供了能够结合(即结合)vegfa的抗原结合分子。本公开提供了特异性结合vegfa的抗原结合分子。根据本公开内容的抗原结合分子可以以纯化或分离的形式提供，即来自其他天然存在的生物材料。

56、如本文所用，“抗原结合分子”是指能够结合靶抗原的分子。术语“抗原结合分子”涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体)、以及抗体片段(例如fv、scfv、fab、scfab、f(ab')2、fab2、双抗体、三抗体、scfv-fc、微型抗体、单域抗体(vhh)等)和适体。

57、更具体地，根据本公开内容的抗原结合分子包含抗原结合多肽部分，其可以被称为“抗原结合结构域”。在优选的实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子包含特异性结合vegfa的单域抗体或由其组成。

58、单域抗体(sdab)-在本领域中也被不同地称为“重链抗体上的单可变结构域”、“vhh”、“纳米抗体”和“重链抗体(hcab)”，并且有时在本文中被称为“dotbodies”-如henry和mackenzie，front immunol.(2018)9:41和bever等，anal bioanal chem.(2016)408(22):5985-6002所描述的，两者均通过引用整体并入本文。

59、单域抗体由单个单体抗体可变域形成。第一个单域抗体是从骆驼科动物中发现的重链抗体改造而来的，软骨鱼也有重链抗体。

60、根据本公开的单域抗体通常包含三个互补决定区cdr:cdr1、cdr2和cdr3。三个cdr共同定义了分子的互补位，即分子与其靶抗原结合的部分。

61、单域抗体还包含每个cdr两侧的框架区(fr)，其为cdr提供支架。从n端到c端，单域抗体包含以下结构:n端-[fr1]-[cdr1]-[fr2]-[cdr2]-[fr3]-[cdr3]-[fr4]-c端。

62、定义抗体cdr和fr有几种不同的约定，例如kabat等，sequences of proteins ofimmunological interest，5th ed.public health service，national institutes ofhealth，bethesda，md(1991)，chothia等，j.mol.biol.196:901-917(1987)，和vbase2中所描述的，retter等，nucl.acids res.(2005)33(suppl 1):d671-d674.中所描述的。

63、在一些实施方案中，抗原结合分子包含本文所述的结合vegfa的单域抗体的cdr，或包含衍生自本文所述的结合vegfa的单域抗体的cdr。在一些实施方案中，抗原结合分子包含本文所述的结合vegfa的单域抗体的fr，或包含衍生自本文所述的结合vegfa的单域抗体的fr。在一些实施方案中，抗原结合分子包含本文所述的结合vegfa的单域抗体的cdr和fr，或包含衍生自本文所述的结合vegfa的单域抗体的cdr和fr。即，在一些实施方案中，抗原结合分子包含本文所述的结合vegfa的单域抗体的氨基酸序列，或包含衍生自本文所述的结合vegfa的单域抗体的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提及的抗原结合分子的cdr和fr根据imgt信息系统(国际imgt(immunogenetics)信息系统(描述于lefranc等人，nucleic acids res.(2015)43(数据库问题):d413-22)，其使用如lefranc等人，dev.comp.immunol.(2003)中描述的imgt v-domain编号规则)27:55-77)、kabat系统(描述于kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版publichealth service，national institutes of health，bethesda，md(1991))或chothia系统(描述于chothia等人，j.mol.biol.196:901-917(1987))定义。

64、在一些实施方案中，本文提及的抗原结合分子(例如单域抗体)的cdr和fr根据kabat系统定义。在一些实施方案中，在seq id no:1、5和16的氨基酸序列中:fr1由位置1至31的氨基酸序列组成；cdr1由第32位至第36位的氨基酸序列组成；fr2是由位置37至50的氨基酸序列组成；cdr2由51-67位的氨基酸序列组成；fr3由68至99位的氨基酸序列组成；cdr3由100-119位氨基酸序列组成；fr4由120-130位的氨基酸序列组成。

65、如本文所用，“衍生自”参考氨基酸序列/结构域的氨基酸序列/结构域包含具有至少60％，例如与参考序列有至少选自65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

66、在一些实施方案中，抗原结合分子包含选自:16c2.1和21a5.1的结合vegfa的单域抗体的cdr、fr和/或完整的氨基酸序列。

67、在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有seq id no:1、5或16之一的氨基酸序列的vegfa结合单域抗体的cdr、fr和/或完整氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有seq id no:1、5或16之一的氨基酸序列的vegfa结合单域抗体的cdr(即cdr 1、2和3)。在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有seq id no:1、5或16之一的氨基酸序列的vegfa结合单域抗体的fr(即fr 1、2、3和4)。在一些实施方案中，抗原结合分子包含具有seqid no:1、5或16之一的氨基酸序列的vegfa结合单域抗体的cdr(即cdr 1、2和3)和fr(即fr1、2、图3和4)。

68、在一些实施方案中，抗原结合分子包含根据以下(1)至(3)之一的单域抗体序列或由其组成:

69、(1)(con)包含以下cdr的单域抗体序列:

70、具有seq id no:13的氨基酸序列的cdr1，具有seq id no:14的氨基酸序列的cdr2，具有seq id no:15的氨基酸序列的cdr3，或其变体，其中cdr1、cdr2或cdr3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。

71、(2)(16c2.1)包含以下cdr的单域抗体序列:

72、具有seq id no:2的氨基酸序列的cdr1，具有seq id no:3的氨基酸序列的cdr2，具有seq id no:4的氨基酸序列的cdr3，或其变体，其中cdr1、cdr2或cdr3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。

73、(3)(21a5.1)包含以下cdr的单域抗体序列:

74、具有seq id no:6的氨基酸序列的cdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的cdr2，具有seq id no:8的氨基酸序列的cdr3，或其变体，其中cdr1、cdr2或cdr3中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。

75、在一些实施方案中，抗原结合分子包含下述(4)的单域抗体序列或由其组成:

76、(4)包含以下fr的单域抗体序列:

77、具有氨基酸序列seq id no:9的fr1，具有氨基酸序列seq id no:10的fr2，具有氨基酸序列seq id no:11的fr3，具有氨基酸序列seq id no:12的fr4，或其变体，其中fr1、fr2、fr3或fr4中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。

78、在一些实施方案中，抗原结合分子包含单域抗体序列或由单域抗体序列组成，所述单域抗体序列包含上文(1)至(3)之一的cdr和上文(4)的fr。

79、在一些实施方案中，抗原结合分子包含根据以下(5)至(7)之一的单域抗体序列或由其组成:

80、(5)(con)单域抗体序列，其包含根据(1)的cdr和根据(4)的fr。

81、(6)(2)单域抗体序列，其包含根据(2)的cdr和根据(4)的fr。

82、(7)(3)单域抗体序列，其包含根据(3)的cdr和根据(4)的fr。

83、在一些实施方案中，抗原结合分子包含根据以下(8)至(10)之一的单域抗体序列或由其组成:

84、(8)(con)单域抗体序列，其包含与seq id no:16的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

85、(9)(16c2.1)单域抗体序列，其包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

86、(10)(21a5.1)单域抗体序列，其包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列。

87、在根据本公开的实施方案中，其中一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代，取代可以是保守取代，例如根据下表。在一些实施方案中，表中间一列中同一块中的氨基酸被取代。在一些实施方案中，表中最右列中同一行中的氨基酸被取代:

88、

89、在一些实施方案中，取代可以是功能保守的。也就是说，在一些实施方案中，与等效的未取代分子相比，取代可能不影响(或基本上不影响)包含取代的抗原结合分子的一种或多种功能特性(例如靶结合)。

90、在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子包含免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域(例如ch1、ch2和/或ch3)。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定序列是或衍生自igg(例如igg1、igg2、igg3、igg4)、iga(例如iga1、iga2)、igd、ige或igm，例如人igg(例如，higg1、higg2、higg3、higg4)、hlga(例如，hlga1、hlga2)、hlgd、hlge或hlgm。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链恒定序列是或衍生自人igg1同种异型(例如g1ml、g1m2、g1m3或g1ml7)的重链恒定序列。

91、在一些实施方案中，抗原结合分子包含与seq id no:26的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。

92、在一些实施方案中，抗原结合分子包含chl区，该chl区包含与seq id no:27的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

93、在一些实施方案中，抗原结合分子包含铰链区，该铰链区包含与seq id no:28的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

94、在一些实施方案中，抗原结合分子包含ch2区，该ch2区包含与seq id no:29的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

95、在一些实施方案中，抗原结合分子包含ch3区，该ch3区包含与seq id no:30的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选自至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。

96、在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合分子包含fc区。

97、fc区由来自一种多肽的ch2和ch3区以及来自另一种多肽的ch2和ch3区组成。两条多肽的ch2和ch3区一起形成fc区。

98、fc区提供与fc受体和免疫系统其他分子的相互作用，以产生功能效应。回顾iggfc介导的效应功能，例如jefferis等人，immunol rev 1998 163:59-76(特此通过引用将其全部内容并入)中所述，并且是通过fc介导的免疫细胞(例如巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、nk细胞和t细胞)之间的相互作用通过fc区和免疫细胞表达的fc受体之间的相互作用来募集和激活，通过fc区与补体蛋白c1q结合募集补体途径组分，随后激活补体级联。fc介导的功能包括fc受体结合、抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)、补体依赖性细胞毒性(cdc)、膜攻击复合物(mac)的形成、细胞脱颗粒、细胞因子和/或趋化因子产生以及抗原加工和呈递。

99、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子包含能够针对包含/表达vegfa的细胞(例如表达vegfa的细胞和/或在细胞表面包含vegfa的复合物)增强/指导adcc、adcp、cdc中的一种或多种和/或增强在其上形成mac或使其细胞脱颗粒。

100、影响fc介导的功能的对抗体fc区的修饰是本领域已知的，参见wang等人，proteincell(2018)9(1):63-73，其全部内容通过引用并入本文。wang等人，protein cell(2018)9(1):63-73的表1总结了已知影响抗体效应功能的示例性fc区修饰。

101、还考虑了多特异性抗原结合分子。“多特异性”是指抗原结合分子表现出与多于一种靶标的特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合分子是双特异性抗原结合分子。在一些实施方案中，抗原结合分子包含至少两个不同的抗原结合结构域。

102、在一些实施方案中，抗原结合分子结合vegfa和另一靶标(例如除vegfa之外的抗原)，因此至少是双特异性的。术语“双特异性”是指抗原结合分子能够与至少两个不同的抗原决定簇特异性结合。

103、应理解，根据本公开内容的抗原结合分子(例如多特异性抗原结合分子)可包含能够结合至抗原结合分子特异性的靶标的抗原结合分子。例如，与vegfa和vegfa以外的抗原结合的抗原结合分子可以包含:(i)与vegfa结合的抗原结合分子，和(ii)与vegfa以外的抗原结合的抗原结合分子。在一些实施方案中，较大抗原结合分子(例如多特异性抗原结合分子)的组分抗原结合分子可以称为，例如，作为较大抗原结合分子的“抗原结合结构域”或“抗原结合区”。

104、还应当理解，根据本公开的抗原结合分子(例如多特异性抗原结合分子)可以包含能够结合抗原结合分子特异性的靶标的抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。

105、在一些实施方案中，多特异性抗原结合分子中除vegfa之外的抗原是免疫细胞表面分子。在一些实施方案中，抗原是癌细胞抗原。在一些实施方案中，抗原是受体分子，例如细胞表面受体。在一些实施方案中，抗原是细胞信号分子，例如细胞因子、趋化因子、干扰素、白细胞介素或淋巴因子。在一些实施方案中，抗原是生长因子或激素。

106、癌细胞抗原是癌细胞表达或过表达的抗原。癌细胞抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌细胞抗原的表达可能与癌症有关。癌细胞抗原可以由癌细胞异常表达(例如，癌细胞抗原可以以异常定位表达)，或者可以由癌细胞以异常结构表达。癌细胞抗原可能能够引发免疫反应。在一些实施方案中，抗原在癌细胞的细胞表面表达(即癌细胞抗原是癌细胞表面抗原)。在一些实施方案中，被本文所述的抗原结合分子结合的抗原部分展示在癌细胞的外表面上(即，在细胞外)。癌细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方案中，癌细胞抗原是其表达与癌症症状的发生、进展或严重性相关的抗原。癌症相关抗原可以与癌症的病因或病理学相关，或者可以由于癌症而异常表达。在一些实施方案中，癌细胞抗原是其表达被癌症细胞上调(例如在rna和/或蛋白质水平)的抗原，例如，与非癌细胞(例如源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以优先由癌细胞表达，并且不由相对的非癌细胞(例如源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)表达。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是突变的癌基因或突变的肿瘤抑制基因的产物。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是过表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的癌抗原、致癌胎儿抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。

107、免疫细胞表面分子可以是在免疫细胞的细胞表面处或之上表达的任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。在一些实施方案中，免疫细胞表面分子的被本发明的抗原结合分子结合的部分位于免疫细胞的外表面上(即，在细胞外)。免疫细胞表面分子可以在任何免疫细胞的细胞表面表达。在一些实施方案中，免疫细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞或先天性淋巴样细胞(ilc)或其前体(例如胸腺细胞或前b细胞)。在一些实施方案中，抗原是cd3多肽(例如cd3s、cd36、cd3y 0g 0y3z)。

108、在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗原结合分子表现出对vegfa的至少单价结合，并且还表现出对除vegfa之外的抗原的至少单价结合。结合价是指抗原结合分子中给定抗原决定簇的结合位点的数量。

109、在一些实施方案中，抗原结合分子包含能够结合vegfa的单域抗体(例如，如本文所述)，以及能够结合除vegfa之外的抗原的抗原结合区(例如，多肽(例如，单域抗体)、fv、fab或抗体)。

110、在一些实施方案中，抗原结合分子包含免疫细胞接合部分。在一些实施方案中，抗原结合分子是免疫细胞接合器。免疫细胞接合器在例如，goebeler和bargou，nat.rev.clin.oncol.(2020)17:418-434；以及ellerman，methods(2019)154:102-117中进行了综述，这两篇文献均通过引用整体并入本文。

111、免疫细胞接合分子包含感兴趣的靶抗原的抗原结合区和用于募集/接合感兴趣的免疫细胞的抗原结合区。免疫细胞接合器通过针对免疫细胞表面分子的特异性抗原结合区域招募/接合免疫细胞。

112、在一些实施方案中，抗原结合分子包含cd3多肽结合部分(例如，能够结合cd3多肽的抗原结合结构域)。研究最充分的免疫细胞接合器是双特异性t细胞接合器(bite)，其包含靶抗原结合结构域和cd3多肽(通常为cd3s)结合结构域，bite通过该结构域招募t细胞。bite与其靶抗原以及t细胞表达的cd3多肽的结合导致t细胞的激活，并最终引导t细胞效应子活性针对表达靶抗原的细胞。其他类型的免疫细胞接合器是本领域众所周知的，并且包括自然杀伤细胞接合器，例如双特异性杀伤细胞接合器(bike)，其募集并激活nk细胞。

113、在一些实施方案中，被免疫细胞接合器接合的免疫细胞是t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，免疫细胞接合器是t细胞接合器。

114、抗原结合分子的具体示例性实施方案

115、在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合分子包含与seq id no:16具有至少70％，优选自75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

116、在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包含与seq id no:1具有至少70％，优选自75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

117、在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子包含与seq id no:5具有至少70％，优选自75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

118、连接子和附加序列

119、除了结合靶抗原所需的氨基酸序列之外，抗原结合分子还可包含额外的氨基酸/氨基酸序列。在一些实施方案中，此类另外的氨基酸/氨基酸序列位于本公开的单域抗体序列的n末端。在一些实施方案中，此类另外的氨基酸/氨基酸序列位于本公开的单域抗体序列的c末端。在一些实施方案中，此类另外的氨基酸/氨基酸序列位于本公开的单域抗体序列的n末端和c末端。

120、在一些实施方案中，抗原结合分子包含氨基酸子序列之间的一个或多个接头序列。例如，可以在本发明的抗原结合分子的抗原结合结构域的一端或两端设置接头序列。

121、接头序列是本领域技术人员已知的，并且在例如chen等人，adv drug deliv rev(2013)65(10):1357-1369中进行了描述，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许由接头序列连接的氨基酸序列的相对移动。柔性接头是本领域技术人员已知的，并且在chen等人，adv drug deliv rev(2013)65(10):1357-1369中鉴定了几种。柔性接头序列通常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。

122、在一些实施方案中，接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，接头序列包含由甘氨酸和丝氨酸残基组成的序列基序的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6或7个之一)拷贝(例如串联)，例如g4s。在一些实施方案中，接头序列具有1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-30个氨基酸的长度。

123、本公开内容的抗原结合分子和多肽可以另外包含另外的氨基酸或氨基酸序列。例如，抗原结合分子和多肽可以包含促进抗原结合分子/多肽的表达、折叠、运输、加工、纯化或检测的氨基酸序列。例如，抗原结合分子/多肽可以包含编码his(例如6xhis)、myc、gst、mbp、flag、ha、e或生物素标签的序列，任选地位于抗原结合分子/多肽的n-或c-末端。在一些实施方案中，抗原结合分子/多肽包含可检测部分，例如荧光、发光、免疫可检测、放射、化学、核酸或酶标记。

124、本公开内容的抗原结合分子和多肽可以另外包含信号肽(也称为前导序列或信号序列)。信号肽通常由5-30个疏水性氨基酸序列组成，形成单个α螺旋。分泌的蛋白质和在细胞表面表达的蛋白质通常包含信号肽。

125、信号肽可以存在于抗原结合分子/多肽的n末端。信号肽可以提供抗原结合分子/多肽的有效运输和分泌。信号肽通常通过切割去除，因此不包含在表达抗原结合分子的细胞分泌的成熟抗原结合分子/多肽中。

126、信号肽对于许多蛋白质来说是已知的，并且被记录在诸如genbank、uniprot、swiss-prot、trembl、蛋白质信息资源、蛋白质数据库、ensembl和interpro等数据库中，和/或可以被识别/预测，例如使用氨基酸序列分析工具例如signalp(petersen等人，2011nature methods 8:785-786)或signal-blast(frank和sippl，2008bioinformatics24:2172-2176)。

127、标签和共轭物

128、在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合分子另外包含可检测部分。

129、在一些实施方案中，抗原结合分子包含可检测部分，例如荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫可检测标记(例如表位标签)、放射性标记、化学标记、核酸标记或酶标记。抗原结合分子可以用可检测部分共价或非共价标记。

130、荧光标记包括例如荧光素、罗丹明、别藻蓝蛋白、曙红和ndb、绿色荧光蛋白(gfp)、铕(eu)、铽(tb)和钐(sm)等稀土螯合物、四甲基罗丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、cy3和cy5。放射性标记包括放射性同位素，例如碘123，碘125，碘126，碘131，碘133，溴77，锝99m，铟111，铟113m，镓67，镓68，钌95，钌97，钌103，钌105，汞207，汞203，铼99m，铼101，铼105，钪47，碲121m，碲122m，碲125m，铥165，铥167，铥168，铜67，氟18，钇90，钯100，铋217和锑211。发光标记包括放射发光、化学发光(例如吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)和生物发光标记。免疫可检测标记包括半抗原、肽/多肽、抗体、受体和配体，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或地高辛。核酸标记包括适体。酶标签包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶。

131、在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合分子缀合至化学部分。化学部分可以是用于提供治疗效果的部分。抗体-药物缀合物在例如parslow等人，《生物医学》，2016年9月；4(3):14中进行了综述。在一些实施方案中，化学部分可以是药物部分(例如细胞毒性剂)，使得抗原结合分子对包含/表达vegfa的细胞(例如表达vegfa的细胞和/或在细胞表面包含vegfa的复合物)表现出细胞毒性。在一些实施方案中，药物部分可以是化疗剂。在一些实施方案中，药物部分选自加利车霉素、dm1、dm4、单甲基auristatin e(mmae)、单甲基auristatin f(mmaf)、sn-38、阿霉素、多卡霉素、d6.5和pbd。

132、抗原结合分子的功能特性

133、本文描述的抗原结合分子可以通过参考某些功能特性来表征。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子可以具有一种或多种以下特性:结合vegfa(例如人vegfa和/或小鼠vegfa)；抑制vegfa和vegfr(/.e.vegfa受体，例如vegfr1)之间的相互作用；抑制vegfa/vegfr介导的信号传导；热处理后保留与vegfa的结合；减少表达vegfa的细胞数量/比例；增加表达vegfa的细胞的细胞杀伤。

134、应当理解，给定的抗原结合分子可以表现出一种以上在前一段中列举的特性。可以使用合适的测定来评估给定抗原结合分子的前一段中列举的性质。测定可以是，例如体外测定，可以是无细胞或基于细胞的测定。或者，测定可以是，例如体内测定，即在非人类动物中进行。测定可以使用被可检测实体标记的物种以促进它们的检测。

135、此类测定结果的分析可包括确定达到相关活性最大水平的50％时的浓度。达到相关活性最大水平的50％时的抗原结合分子的浓度可以称为抗原结合分子相对于相关活性的“半最大有效浓度”，其也可以称为“ec 50”。举例来说，给定抗原结合分子与vegfa的结合的ec50可以是达到与相关物种的结合的最大水平的50％时的浓度。

136、根据特性，ec50也可称为“半最大抑制浓度”或“ic50”，这是观察到给定特性的最大抑制水平的50％时的抗原结合分子的浓度。作为说明，给定抗原结合分子抑制vegfa和vegfr(例如vegfr1)之间相互作用的ic 50可以是实现最大抑制水平的50％时的浓度。

137、本文所述的抗原结合分子和抗原结合结构域优选表现出与vegfa的特异性结合。如本文所用，“特异性结合”是指对抗原具有选择性的结合，并且其可以与对非靶抗原的非特异性结合相区别。特异性结合靶分子的抗原结合分子/结构域优选结合该靶分子，且比其结合其他非靶分子具有更大的亲和力和/或更长的持续时间。

138、给定多肽特异性结合给定分子的能力可以通过根据本领域已知的方法进行分析来确定，例如通过elisa、表面等离子共振(spr；参见例如hearty等人，methods mol biol(2012)907:411-442)、bio-layer interferometry(参见例如lad等人，(2015)j biomolscreen 20(4):498-507)、流式细胞术或放射性标记抗原结合测定(ria)酶联免疫吸附测定。通过这种分析，可以测量和量化与给定分子的结合。在一些实施方案中，结合可以是在给定测定中检测到的响应。

139、在一些实施方案中，抗原结合分子与非靶分子的结合程度小于抗体与靶分子的结合的约10％，例如通过elisa、spr、生物层干涉测量法或ria测量。或者，结合特异性可以用结合亲和力来反映，其中抗原结合分子以至少0.1个数量级(即0.1x10n，其中n是代表大于抗原结合分子对非靶分子的kd的数量级的整数，可以任选地是至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0之一。

140、与vegfa的结合可以通过生物层干涉测量法来确定，例如如本发明实施例8所述。

141、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子结合vegfa。在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子结合包含vegfa的多肽复合物。

142、在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子以亚微摩尔亲和力结合vegfa，即kd<1x 10-6m。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子以纳摩尔范围内的亲和力结合vegfa，即kd＝9.9x 10-7至1x 10-9m。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子以亚纳摩尔亲和力结合vegfa，即kd<1x 10-9m。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子以皮摩尔范围内的亲和力结合vegfa，即kd＝9.9x 10-10至1x 10-12m。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子以亚皮摩尔亲和力结合vegfa，即k d<1×1012m。

143、在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子以5pm或更低的kd结合vegfa(例如人vegf165)，优选自<5pm、<2pm、<1pm、<500nm、<100nm、<75nm、<50nm、<40nm、<30nm、<20nm、<15nm、<12.5nm、<10nm，<9nm，<8nm，<7nm，<6nm，<5nm，<4nm<3nm，<2nm，<1nm，<500pm，<400pm，<300pm，<200pm，<100pm，<75pm，<50pm，<45pm，<40pm，<35pm，<30pm，<25pm，<20pm、<15pm或<10pm。在一些实施方案中，抗原结合分子以kd＝≤1nm、<500pm、<400pm、<300pm、<200pm、<100pm、<75pm、<50pm、<45pm、<40pm、<35pm、<30pm、<25pm、<20pm、<15pm或<10pm的亲和力结合vegfa(例如人vegf165)。

144、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子在相同的测试中以与雷珠单抗(即，通过seq id no:74和75的多肽缔合而形成的分子)相似的kd(例如，通过bli测定，例如，如本公开内容的实施例8中所述)结合vegfa(例如，人vegf165)，其kd(例如通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)在同样的测试中与雷珠单抗测定的kd相比，其kd>0.5倍且<2倍，例如选自>0.55倍且<1.9倍、>0.6倍且<1.8倍、>0.65倍且<1.7倍、>0.7倍且<1.6倍、>0.75倍且<1.5倍、>0.8倍且<1.4倍、>0.85倍且<1.3倍、>0.9倍且<1的0.2倍、>0.95倍和<1.1倍。

145、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子在相同测定中以低于雷珠单抗测定的kd(例如通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)的kd结合vegfa(例如人vegf165)。在一些实施方案中，抗原结合分子在同样测试中(例如通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)与雷珠单抗测定的kd相比，其结合vegfa(例如人vegf165)的kd小于1倍，例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍或<0.5。

146、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子以与贝伐单抗(即通过seq idno:76和77的多肽缔合而形成的分子)相似的kd(例如通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)结合vegfa(例如人vegf165)，其kd(例如通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)在同样的测试中与贝伐单抗测定的kd相比，其kd>0.5倍且<2倍，例如选自>0.55倍且<1.9倍、>0.6倍且<1.8倍、>0.65倍且<1.7倍、>0.7倍且<1.6倍、>0.75倍且<1.5倍、>0.8倍且<1.4倍、>0.85倍且<1.3倍、>0.9倍且<1.2倍、>0.95倍且<1.1倍。

147、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子在相同测试中以低于贝伐单抗测定的kd(例如，通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)的kd结合vegfa(例如人vegf165)。在一些实施方案中，抗原结合分子在同样的测试中(例如，通过bli测定，例如如本公开实施例8中所述)与贝伐单抗测定的kd相比，其结合vegfa(例如人vegf165)的kd小于1倍、例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍或<0.5倍。

148、本公开内容的抗原结合分子可以结合vegfa的特定感兴趣区域。根据本公开的抗原结合分子可以结合vegfa的线性表位，其由连续的氨基酸序列(即氨基酸一级序列)组成。在一些实施方案中，抗原结合分子可以结合vegfa的构象表位，其由氨基酸序列的不连续氨基酸序列组成。

149、抗原结合分子结合的给定靶分子的区域可以由技术人员使用本领域熟知的各种方法来确定，包括抗体-抗原复合物的x射线共结晶分析、肽扫描、诱变图谱、通过质谱法的氢-氘交换分析、噬菌体展示、竞争elisa和基于蛋白水解的“保护”方法。此类方法描述于例如gershoni等人，biodrugs，2007，21(3):145-156，其全部内容通过引用并入本文。

150、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子与vegfa的相同区域或vegfa的重叠区域结合，所述vegfa的区域由包含选自以下的vegfa结合单域抗体的cdr、fr和/或完整氨基酸序列的抗原结合分子结合:16c2.1和21a5.1。

151、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子结合vegfa的区域，vegfa通过该区域结合vegfr(例如vegfr1和/或vegfr2)。

152、在一些实施方案中，抗原结合分子结合vegfa中与vegfr(例如vegfr1)结合区域。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfr(例如vegfr1)和vegfa之间的相互作用。在一些实施方案中，抗原结合分子是vegfr(例如vegfr1)与vegfa结合的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，抗原结合分子阻断vegfa与vegfr(例如vegfr1)的结合。在一些实施方案中，抗原结合分子占据vegfr(例如vegfr1)结合的vegfa区域，从而抑制vegfr(例如vegfr1)与vegfa之间的相互作用。在一些实施方案中，抗原结合分子从包含vegfa和vegfr(例如vegfr1)的复合物中置换vegfr(例如vegfr1)。

153、抗原结合分子抑制两个因子之间相互作用的能力可以通过下述方法来测定，例如，在抗体/片段存在下，或在相互作用配偶体之一或两者与抗体/片段温育后分析相互作用来确定。一个合适的测定方法用来确定给定的抗原结合分子抑制两个相互作用伙伴之间的相互作用的例子是竞争性elisa测定。抑制给定相互作用(例如vegfa和vegfr之间)的抗原结合分子通过观察与不存在抗原结合分子时(或存在适当的对照抗原结合分子时)的相互作用水平相比，在存在抗原结合分子的情况下或在相互作用配偶体之一或两者与抗原结合分子一起温育后观察到相互作用配偶体之间的相互作用水平的减少/降低来鉴定。可以在体外进行合适的分析，例如使用重组相互作用配偶体或使用表达相互作用配偶体的细胞。表达相互作用配偶体的细胞可以内源地表达相互作用配偶体，或者可以通过引入细胞中的核酸表达相互作用配偶体。为了此类测定的目的，相互作用配偶体和/或抗原结合分子之一或两者可以被标记或与可检测实体结合使用以用于检测和/或测量相互作用水平的目的。

154、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子抑制vegfa与vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，其ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)为10pm或更低，优选自<5pm、<2pm、<1pm、<500nm、<100nm、<75nm、<50nm、<40nm、<30nm、<20nm、<15nm、<12.5nm、<10nm、<9nm、<8nm、<7nm、<6nm、<5nm、<4nm或<3nm。

155、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，其ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开内容实施例9中描述的竞争elisa)在同一测定中与针对雷珠单抗(即通过seq id no:74和seqid no:74的多肽缔合而形成的分子)测定的抑制此类相互作用的ic50相似。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)在相同测定中是雷珠单抗抑制这种相互作用的>0.5倍且<2倍，例如选自>0.55倍且<1.9倍、>0.6倍且<1.8倍、>0.65倍且<1.7倍、>0.7倍且<1.6倍、>0.75倍且<1.5倍、>0.8倍且<1.4倍、>0.85倍且<1.3倍、>0.9倍且<1.2倍、>0.95倍且<1.1倍。

156、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，其ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)低于在相同测定中对雷珠单抗测定的抑制此类相互作用的ic50。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)在相同测定中是雷珠单抗抑制这种相互作用的小于1倍，例如1倍，例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍或<0.5倍。

157、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，其ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开内容实施例9中描述的竞争elisa)与针对贝伐单抗(即通过seq id no:76和seq id no:76的多肽缔合而形成的分子)在相同试验中测定的抑制此类相互作用的ic50相似。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)在相同测定中是贝伐单抗抑制这种相互作用的ic50的>0.5倍且<2倍，例如选自>0.55倍且<1.9倍、>0.6倍且<1.8倍、>0.65倍且<1.7倍、>0.7倍且<1.6倍、>0.75倍且<1.5倍、>0.8倍且<1.4倍、>0.85倍且<1.3倍、>0.9倍且<1.2倍、>0.95倍且<1.1倍。

158、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，其ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)低于在相同测定中针对贝伐单抗测定的抑制此类相互作用的ic50。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa和vegfr1(例如人vegf121和人vegfr1)之间的相互作用，ic50(例如通过竞争elisa测定，例如本公开实施例9中描述的竞争elisa)在同一测定中是贝伐珠单抗抑制这种相互作用的ic50的小于1倍，例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍或<0.5倍。

159、在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(即，由vegfa与vegfr的结合介导的信号传导)。可以使用表达vegfr的细胞来分析vegfa/vegfr介导的信号传导，例如在用于检测和/或定量vegfa/vegfr介导的信号传导的测定中。

160、用于研究vegfa/vegfr介导的信号传导的合适测定法包括用于检测因vegfa/vegfr介导的信号传导而被磷酸化/激活/表达的因子的磷酸化/活性/表达的测定法。此类测定法可以包括在vegfa存在下使表达vegfr的细胞与根据本公开内容的抗原结合分子接触。用于研究vegfa/vegfr介导的信号传导的测定可以包括分析通过pi3k/akt、mapk/erk和/或plc-y途径、和/或通过scr和/或fak的信号传导。

161、在一些实施方案中，本公开内容的抗原结合分子能够将vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)抑制到与在不存在抗原结合分子的情况下(或在存在适当的对照抗原结合分子的情况下)的信号转导相比小于1倍，例如1选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍、<0.5倍、<0.45倍、<0.4倍、<0.35倍、<0.3倍、<0.25倍、<0.2倍、<0.15倍、<0.1倍倍，<0.05倍，或<0.01倍的水平。

162、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)，其ic50与在相同测定中针对雷珠单抗(即通过seq id no:74和75的多肽缔合而形成的分子)测定的抑制此类相互作用的ic50相似。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)，其ic 50为在相同测定中雷珠单抗抑制此类信号传导的ic50值的>0.5倍且<2倍，例如选自>0.55倍且<1.9倍、>0.6倍且<1.8倍、>0.65倍且<1.7倍、>0.7倍且<1.6倍、>0.75倍且<1.5倍、>0.8倍且<1.4倍、>0.85倍且<1.3倍、>0.9倍且<1.2倍、>0.95倍且<1.1倍。

163、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)，其ic50低于在相同测定中对雷珠单抗测定的抑制此类相互作用的ic50。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)的ic50值与在相同测定中雷珠单抗抑制此类信号转导的ic50值相比小于1倍、例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍或<0.5倍。

164、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，由人vegf121与人vegfr1结合介导的信号传导)，其ic50与在相同测定中针对贝伐单抗(即通过seq id no:76和77的多肽缔合而形成的分子)测定的抑制此类相互作用的ic50相似。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)，其ic 50为在相同测定中贝伐单抗抑制此类信号传导的ic50值的>0.5倍且<2倍，例如选自>0.55倍且<1.9倍、>0.6倍且<1.8倍、>0.65倍且<1.7倍、>0.7倍且<1.6倍、>0.75倍且<1.5倍、>0.8倍且<1.4倍、>0.85倍且<1.3倍、>0.9倍且<1.2倍、>0.95倍且<1.1倍。

165、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)，其ic50低于在相同测定中针对贝伐单抗测定的抑制此类相互作用的ic50。在一些实施方案中，抗原结合分子抑制vegfa/vegfr介导的信号传导(例如，通过人vegf121与人vegfr1的结合介导的信号传导)的ic50值与在同一测定中贝伐珠单抗抑制此类信号传导的ic50值相比小于1倍，例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍或<0.5倍。

166、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子在热处理之前和之后以相似的亲和力结合vegfa(例如人vegfa)。热处理可以包括在适当的缓冲液(例如包含0.1％bsa和0.01％tween-20的pbs溶液的缓冲液)中在室温、60℃、70℃或80℃下温育1小时。热处理可以如本公开的实施例10中所述进行。

167、在一些实施方案中，抗原结合分子在热处理之前和在室温下热处理1小时之后对vegfa表现出相似的亲和力。在一些实施方案中，抗原结合分子在热处理之前和在60℃热处理1小时之后显示出对vegfa的相似亲和力。在一些实施方案中，抗原结合分子在热处理之前和在70℃热处理1小时之后显示出对vegfa的类似亲和力。在一些实施方案中，抗原结合分子在热处理之前和在80℃热处理1小时之后对vegfa表现出相似的亲和力。

168、本文中，与参考结合亲和力“相似”的结合亲和力是指与用同样方法测定的参考亲和力相比在50％以内的结合亲和力，例如选自40％、45％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

169、热处理前后与vegfa(例如人vegfa)结合的kd可能相似。

170、在本文中，与参考值“相似”的kd值可以是与参考值相比>0.5倍且<2倍，例如选自>0.7倍且<1.5倍、>0.75倍且<1.25倍、>0.8倍且<1.2倍、>0.85倍且<1.15倍、>0.9倍且<1.1倍、>0.91倍且<1.09倍、>0.92倍且<1.08倍、>0.93倍以及<1.07倍、>0.94倍且<1.06倍、>0.95倍且<1.05倍、>0.96倍且<1.04倍、>0.97倍且<1.03倍、>0.98倍且<1.02倍、或>0.99倍且<1.01倍。

171、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子可以增强(即上调、增强)包含/表达vegfa的细胞的细胞杀伤。

172、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子能够减少包含/表达vegfa的细胞的数量/比例。在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子能够消耗/增强此类细胞的消耗。

173、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子，在用相同实验方法的情况下，将包含/表达vegfa的细胞的数量/比例减少至与在没有抗原结合分子时或在有相同量的适当对照抗原结合分子存在下观察到的此类细胞数量/比例相比小于1倍，例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍、<0.5倍、<0.45倍、<0.4倍、<0.35倍、<0.3倍、<0.25倍、<0.2倍、<0.15倍、<0.1倍倍，<0.05倍，或<0.01倍。

174、根据本公开内容的抗原结合分子可以包含用于增强包含/表达vegfa的细胞的数量/比例的减少的一个或多个部分。例如，根据本公开内容的抗原结合分子可以是，例如，包含fc区和/或药物部分。

175、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子包含能够增强/引导针对包含/表达vegfa的细胞的adcc、adcp、cdc中的一种或多种，和/或增强包含/表达vegfa的细胞的mac形成或细胞脱粒的fc区。

176、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子能够针对包含/表达vegfa的细胞增强/引导adcc。

177、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子包含药物部分。抗原结合分子可以缀合至药物部分。抗体-药物缀合物的在例如parslow等人，biomedicines.2016sep；4(3):14中进行了综述(通过引用并入上文)。在一些实施方案中，药物部分是或包含细胞毒性剂，使得抗原结合分子对包含/表达vegfa的细胞表现出细胞毒性。在一些实施方案中，药物部分是或包含化疗剂。

178、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子包含免疫细胞接合部分。在一些实施方案中，抗原结合分子包含cd3多肽结合部分(例如，能够结合cd3多肽的抗原结合结构域)。

179、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子能够增强/指导针对包含/表达vegfa的细胞的t细胞介导的溶细胞活性。

180、在一些实施方案中，根据本公开的抗原结合分子，在给定的测定中，将包含/表达vegfa的细胞的数量/比例与不存在抗原结合分子或存在相同量的适当对照抗原结合分子的情况下观察到的此类细胞的数量/比例减少至小于1倍，例如选自<0.99倍、<0.95倍、<0.9倍、<0.85倍、<0.8倍、<0.75倍、<0.7倍、<0.65倍、<0.6倍、<0.55倍、<0.5倍、<0.45倍、<0.4倍、<0.35倍、<0.3倍、<0.25倍、<0.2倍、<0.15倍、<0.1倍的倍、<0.05倍、或<0.01倍。

181、在一些实施方案中，根据本公开内容的抗原结合分子，在给定的测定中，将包含/表达vegfa的细胞的杀伤水平与不存在抗原结合分子或存在相同量的适当对照抗原结合分子的情况下观察到的此类细胞的杀灭水平相比，提高至大于1倍，例如选自>1.5倍、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍、>15倍、>20倍、>30倍、>40倍或>50倍。

182、嵌合抗原受体(car)

183、本公开还提供了包含本公开的抗原结合多肽的嵌合抗原受体(car)。

184、car是重组受体，提供抗原结合和t细胞激活功能。car结构和工程在例如dotti等人，immunol rev(2014)257(1)中进行了综述，特此通过引用将其全部内容并入。car包含与细胞膜锚定区和信号传导区连接的抗原结合区。任选的铰链区可以提供抗原结合区和细胞膜锚定区之间的分离，并且可以充当柔性接头。

185、本公开的car包含抗原结合区，其包含本公开的抗原结合分子或由本公开的抗原结合分子组成，或者其包含根据本公开的单域抗体序列或由本公开的单域抗体序列组成。即，根据本公开的抗原结合分子/单域抗体序列包含在或构成car的抗原结合区。

186、细胞膜锚定区设置在car的抗原结合区和信号传导区之间，并提供将car锚定至表达car的细胞的细胞膜，其中抗原结合区位于细胞外空间，而信号传导区位于细胞内部。在一些实施方案中，car包含细胞膜锚定区，所述细胞膜锚定区包含氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列包含cds-z、cd4、cd8或cd28之一的跨膜区氨基酸序列、由其组成或衍生自cds-z、cd4、cd8或cd28之一的跨膜区氨基酸序列。如本文所用，“衍生自”参考氨基酸序列的区域包含具有至少60％的氨基酸序列与参考氨基酸序列具有序列同一性，例如选自至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

187、car的信号传导区域可激活t细胞。car信号传导区域可以包含cds-z胞内结构域的氨基酸序列，其提供用于磷酸化和激活表达car的t细胞的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。包含其他含有itam的蛋白质(例如fcγri)的序列的信号传导区也已被用于car中(haynes等人，2001jimmunol 166(1):182-187)。car的信号传导区域还可以包含源自共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列，以促进表达car的t细胞在与靶蛋白结合后的激活。合适的共刺激分子包括cd28、0x40、4-1bb、icos和cd27。在某些情况下，car被设计为提供不同细胞内信号通路的共同刺激。例如，与cd28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)途径，而4-1bb介导的信号传导则通过tnf受体相关因子(traf)衔接蛋白。因此，car的信号传导区域有时包含源自超过一种共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列。在一些实施方案中，本公开内容的car包含一种或多种共刺激序列，所述共刺激序列包含氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列包含cd28、0x40、4-1bb、icos和cd27中的一种或多种的胞内结构域的氨基酸序列、由其组成或衍生自所述氨基酸序列。

188、任选的铰链区可以提供抗原结合结构域和跨膜结构域之间的分离，并且可以充当柔性接头。铰链区可以源自igg1。在一些实施方案中，本公开的car包含铰链区，该铰链区包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，该氨基酸序列包含igg1铰链区的氨基酸序列、由igg1铰链区的氨基酸序列组成或衍生自igg1铰链区的氨基酸序列。

189、还提供了包含根据本公开的car的细胞。根据本公开的car可以用于产生表达car的免疫细胞，例如免疫细胞。car-t或car-nk细胞。将car工程化到免疫细胞中可以在体外培养过程中进行。

190、本公开内容的car的抗原结合区可以以任何合适的形式提供，例如，scfv、scfab等。

191、核酸和载体

192、本公开提供了编码根据本公开的抗原结合分子和car的核酸。在一些实施方案中，核酸包含dna和/或rna或由dna和/或rna组成。

193、本公开内容还提供了包含根据前述的核酸的载体。

194、根据本公开的核酸和载体可以以纯化或分离的形式提供，即来自其他核酸或天然存在的生物材料。

195、根据本公开内容的核酸的核苷酸序列可以包含在载体中，例如表达载体。本文所用的“载体”是用作将外源核酸转移至细胞中的载体的核酸分子。载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。此类载体可以包括与编码待表达序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从根据本公开内容的载体表达肽或多肽。

196、术语“可操作地连接”可以包括其中选择的核酸序列和调节核酸序列(例如启动子和/或增强子)以将核酸序列的表达置于调节序列的影响或控制下(从而形成表达盒)的方式共价连接的情况。因此，如果调节序列能够影响核酸序列的转录，则调节序列可操作地连接至所选核酸序列。然后可以将所得转录物翻译成所需的肽/多肽。

197、合适的载体包括质粒、二元载体、dna载体、mrna载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(mlv)衍生的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、牛痘病毒载体和疱疹病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。

198、在一些实施方案中，载体可以是真核载体，例如真核载体。载体，其包含在真核细胞中从载体表达蛋白质所必需的元件。在一些实施方案中，载体可以是哺乳动物表达载体，例如哺乳动物表达载体。包含巨细胞病毒(cmv)或sv40启动子以驱动蛋白质表达。

199、包含/表达抗原结合分子/car的细胞

200、本公开还提供了包含或表达根据本公开的抗原结合分子和car的细胞。还提供了包含或表达根据本公开内容的核酸或载体的细胞。

201、细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人)或非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿类动物(包括啮齿动物目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括牛，例如奶牛或牛目中的任何动物)、马(包括马科动物中的任何动物)、驴和非人类哺乳动物)。

202、在一些实施方案中，细胞是或源自常用于表达用于人类治疗的多肽的细胞类型。示例性细胞在例如kunert and reinhart，

203、appl microbiol biotechnol.(2016)100:3451-3461中有描述(特此通过引用将其全部内容并入)，并且包括例如cho、hek 293、per.c6、ns0和bhk细胞。

204、本公开还提供了用于产生包含根据本公开的核酸或载体的细胞的方法，包括将根据本公开的核酸或载体引入细胞中。在一些实施方案中，将根据本公开的分离的核酸或载体引入细胞中包括转化、转染、电穿孔或转导(例如逆转录病毒转导)。

205、本公开还提供了用于产生表达/包含根据本公开的抗原结合分子/car的细胞的方法，包括将根据本公开的核酸或载体引入细胞中。在一些实施方案中，该方法另外包括在适合于细胞表达核酸/载体的条件下培养细胞。在一些实施方案中，该方法在体外进行。

206、本公开还提供了通过根据本公开的方法获得的或可获得的细胞。

207、生产抗原结合分子和多肽

208、根据本公开内容的抗原结合分子和多肽可以根据技术人员已知的用于产生多肽的方法来制备。

209、多肽可以通过化学合成来制备，例如液相或固相合成。例如，可以使用例如chandrudu等人，molecules(2013)，18:4373-4388中描述的方法合成肽/多肽，该文献通过引用整体并入本文。

210、或者，抗原结合分子和多肽可以通过重组表达来产生。适合重组产生多肽的分子生物学技术是本领域众所周知的，例如green and sambrook，molecular cloning:alaboratory manual(4th edition)，cold spring harbor press，2012，and in natmethods.(2008)；5(2):135-146中阐述的那些技术，两者均通过引用整体并入本文。用于重组产生抗原结合分子的方法也描述于frenzel等人，frontimmunol.1999，1995。(2013)；4:217以及kunert和reinhart，appl microbiol biotechnol。(2016)100:3451-3461，两者的全部内容通过引用并入本文。

211、对于根据本公开内容的重组生产，可以使用适合表达多肽的任何细胞。细胞可以是原核生物或真核生物。在一些实施方案中，细胞是原核细胞，例如古细菌或细菌的细胞。在一些实施方案中，细菌可以是革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科细菌，例如大肠杆菌。在一些实施方案中，细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如上文描述的细胞。

212、在一些情况下，细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许进行与真核细胞相同的折叠或翻译后修饰。此外，真核生物中可能有非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白质。还可以使用增强蛋白质分泌到培养基中的特定质粒。

213、在一些实施方案中，多肽可以通过无细胞蛋白质合成(cfps)来制备，例如，根据zemella等人在chembiochem(2015)16(17):2420-2431，描述的系统，其全部内容通过引用并入本文。

214、生产可以涉及经修饰以表达目的多肽的真核细胞的培养或发酵。培养或发酵可以在提供有适当的营养物、空气/氧气和/或生长因子的生物反应器中进行。可以通过从细胞中分离培养基/发酵液、提取蛋白质内容物并分离单个蛋白质以分离分泌的多肽来收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如green和sambrook，分子克隆:实验室手册(第四版；以上通过引用并入本文)中。

215、生物反应器包括一个或多个可在其中培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，反应物连续流入反应器，并且培养细胞连续流出反应器。或者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如ph、氧气、进出容器的流速以及容器内的搅拌，从而为培养的细胞提供最佳条件。

216、培养表达抗原结合分子的细胞后，可以分离或纯化抗原结合分子(例如从细胞培养物上清液)。可以采用任何合适的方法来分离/纯化通过培养物中的细胞表达产生的感兴趣的多肽。

217、为了分离多肽，可能需要将细胞与营养培养基分离。如果多肽是从细胞分泌的，则可以通过离心从含有所分泌的目的多肽的培养基中分离细胞。如果感兴趣的多肽收集在细胞内，则蛋白质分离可包括离心以将细胞与细胞培养基分离、用裂解缓冲液处理细胞沉淀以及细胞破碎，例如细胞破碎。通过超声处理、快速冻融或渗透裂解。

218、然后可能需要从上清液或培养基中分离感兴趣的多肽，其可能含有其他蛋白质和非蛋白质组分。从上清液或培养基中分离蛋白质成分的常用方法是沉淀。不同溶解度的蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵下沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下，可提取水溶性蛋白质。因此，通过添加不同浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可以使用透析从分离的蛋白质中除去硫酸铵。

219、用于区分不同蛋白质的其他方法是本领域已知的，例如离子交换层析和尺寸层析。这些可以用作沉淀的替代方案或者可以在沉淀之后进行。

220、一旦从培养物中分离出感兴趣的多肽，可能需要或必须浓缩该多肽。许多用于浓缩蛋白质的方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。

221、组合物

222、本公开还提供了包含本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体和细胞的组合物。

223、本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体和细胞可以配制为用于临床用途的药物组合物或药物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。

224、本公开的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体(例如脂质体、胶束、微球体、纳米颗粒)、稀释剂/赋形剂(例如淀粉、纤维素、

225、纤维素衍生物、多元醇、葡萄糖、麦芽糊精、硬脂酸镁)、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂(例如维生素a、维生素e、维生素c、棕榈酸视黄酯、硒、半胱氨酸、蛋氨酸、柠檬酸、柠檬酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、抗氧化剂(例如维生素a、维生素e、维生素c、棕榈酸视黄酯、硒))、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、硬脂酸、植物硬脂)、粘合剂(例如蔗糖、乳糖、淀粉、纤维素、明胶、聚乙二醇(peg)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、木糖醇、山梨醇、甘露醇)、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、掩蔽剂或着色剂(例如钛)氧化物)。

226、本文使用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在合理的医学判断范围内适合与所讨论的受试者(例如人类受试者)的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并与合理的效益/风险比相称。根据本公开内容的组合物的每种载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、粘合剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、掩蔽剂、着色剂、调味剂或甜味剂也必须在与制剂的其他成分相容的意义上是“可接受的”。合适的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、粘合剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、掩蔽剂、着色剂、矫味剂或甜味剂可以在标准药学教科书中找到，例如，remington’s the science and practice ofpharmacy’(ed.a.adejare)，第23版(2020)，academic press。

227、该组合物可以配制用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或经皮施用途径。在一些实施方案中，药物组合物/药物可以配制用于通过注射或输注施用，或通过摄入施用。

228、合适的制剂可以包含在无菌或等渗介质中的抗原结合分子。药物和药物组合物可以配制为流体形式，包括凝胶形式。流体制剂可以配制用于通过注射或输注(例如通过导管)至人体或动物体的选定区域施用。

229、在一些实施方案中，组合物被配制用于注射或输注，例如注射或输注。进入感兴趣的血管或组织/器官。

230、本公开还提供了用于产生药学上有用的组合物的方法，此类产生方法可以包括选自以下的一个或多个步骤:产生本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体或细胞；分离本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体或细胞；和/或将本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。

231、例如，本公开的另一方面涉及配制或生产用于治疗疾病/病症(例如本文所述的疾病/病症)的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过将本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。

232、治疗和预防应用

233、本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于治疗和预防方法。

234、本公开提供了本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物，其用于医学治疗或预防的方法中。还提供了本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物在制造用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。还提供了治疗或预防疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物。

235、根据本公开的治疗性或预防性干预可有效减少疾病/病症的发生或进展、减轻疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的病理。干预措施可能有效预防疾病/病症的进展，例如防止疾病/病症恶化或减缓疾病/病症的发展速度。在一些实施方案中，该方法可以导致疾病/病症的改善，例如疾病/病症。疾病/病症的症状减轻或疾病/病症的严重性/活动性的一些其他相关性的减轻。在一些实施方案中，该方法可以预防疾病/病症的后期发展(例如，更严重的阶段，或慢性阶段)。

236、术语“发展”、“发展中”和“发展”，例如本文所用的“病症的”指疾病的发作以及疾病状态/其相关物的进展、恶化或恶化。

237、应当理解，本公开的制品可用于治疗/预防任何疾病/病症，所述疾病/病症将从vegfa、vegfa/vegfr介导的信号传导水平的降低、包含/表达vegfa的细胞数量的减少和/或表达vegfr的细胞活性的降低获得治疗或预防益处。疾病/状况可能例如:可以是病理学上涉及vegfa、vegfa/vegfr介导的信号传导和/或包含/表达vegfa/vegfr的细胞的疾病/病症，例如，vegfa/vegfr介导的信号传导水平升高和/或包含/表达vegfa/vegfr的细胞数量增加与疾病/病症的发作、发展或进展和/或疾病/病症的一种或多种症状的严重性正相关的疾病/病症，或者vegfa/vegfr介导的信号传导水平升高和/或细胞数量增加是疾病/病症的发作、发展或进展的危险因素。

238、根据本文公开的方面和实施方案的治疗和预防主要涉及以vegfa/vegfr介导的信号传导为特征的疾病/病症。

239、在一些实施方案中，根据本公开要治疗/预防的疾病/病症是以vegfa表达水平增加为特征的疾病/病症，例如vegfa表达水平增加。与不存在疾病/病症时vegfa的表达水平相比。在一些实施方案中，根据本公开要治疗/预防的疾病/病症是以表达vegfr的细胞的数量/比例/活性增加为特征的疾病/病症，例如，vegfr。与不存在疾病/病症时表达vegfr的细胞的数量/比例/活性相比。

240、vegfa/vegfr介导的信号传导及其在疾病中的作用在综述中提及，例如karamandevelopment(2018)145(14):dev151019，ferrara and adamis，nat rev drug discov.(2016)15(6):385-403，and claesson-welsh and welsh，j intern med.(2013)273(2):114-27，所有这些均通过引用整体并入本文。

241、vegfa/vegfr介导的信号传导与多种疾病的发病机制有关。vegfa可促进糖尿病视网膜病变和湿性年龄相关性黄斑变性等眼部疾病患者的血管生成、血视网膜屏障破坏、炎症和视力丧失。

242、vegf和vegf受体也在非内皮细胞中表达，包括一些肿瘤细胞。肿瘤细胞分泌的vegfa刺激内皮细胞的增殖和存活，导致新血管的形成，促进肿瘤生长。vegfa中和抗体的开发和使用首次提供了肿瘤生长依赖于血管生成的直接证据，并证实了vegfa在此过程中的重要性。

243、在一些实施方案中，根据本发明治疗的疾病/病症选自:以病理性(即过度)血管生成为特征的疾病、癌症、表达vegfa的癌症(即包含表达vegfa的细胞的癌症；例如包含与相当的非癌性细胞的表达水平相比具有升高的vegfa表达水平的细胞的癌症)、表达vegfr的癌症(即包含表达vegfr的细胞的癌症；例如癌症)包括与相当的非癌性细胞的表达水平相比具有升高的vegfr表达水平的细胞)、眼部疾病、视网膜病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、湿性(即新生血管性)年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、近视性脉络膜新生血管形成、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、中心性浆液性视网膜病、眼部肿瘤、角膜新生血管形成，炎症性疾病、自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、多发性硬化症、败血症、运动神经元疾病和肌萎缩侧索硬化症。

244、应当理解，前一段中列举的某些疾病是相互关联的。例如，以病理性血管生成为特征的疾病包括癌症和眼部疾病。

245、如本文所用，“病理性血管生成”是指血管生成(即，从现有血管丛生长出新血管)，其中血管生成有助于疾病的发生和/或进展。

246、在一些实施方案中，根据本公开内容待治疗/预防的疾病/病症是癌症。癌症可以是任何不需要的细胞增殖(或通过不需要的细胞增殖表现出来的任何疾病)、赘生物或肿瘤。癌症可以是良性的或恶性的，并且可以是原发性的或继发性的(转移性的)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖并且可以位于任何组织中。癌症可以是源自例如组织/细胞的癌症。肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵膈、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、大网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。

247、待治疗的肿瘤可以是神经或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢或周围神经系统，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，实例包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病(cml)、急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、非小细胞肺癌、血液癌和肉瘤。

248、治疗/预防可以针对以下一项或多项:延迟/预防癌症症状的发作/进展、降低癌症症状的严重性、减少癌症细胞的存活/生长/侵袭/转移、减少癌症细胞的数量和/或增加受试者的存活。

249、在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包含表达vegfa的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症包含表达vegfr的细胞。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症是vegfa阳性的癌症。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症是vegfr阳性的癌症。在一些实施方案中，癌症过表达vegfa。在一些实施方案中，癌症过表达vegfr。vegfa和/或vegfr的过度表达可以通过检测vegfa和/或vegfr的水平来确定。

250、相关因子的表达高于同等非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。

251、vegfa和/或vegfr表达可以通过任何合适的方法测定。表达可以是基因表达或蛋白质表达。基因表达可以被确定，例如通过检测编码vegfa和/或vegfr的mrna，例如通过定量实时pcr(qrt-pcr)。蛋白质表达可以被测定，例如通过检测vegfa和/或vegfr，例如通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术或elisa。

252、在一些实施方案中，可以基于表达vegfa和/或vegfr、或过表达vegfa和/或vegfr的癌症的检测来选择患者进行本文所述的治疗，例如，在从受试者获得的样本中。

253、vegfa/vegfr拮抗剂已被研究作为治疗/预防多种癌症的药剂，例如kieran等，cold spring harb perspect med.2012dec；2(12):a006593所述(通过引用将其全部内容并入本文；参见例如表2)。在一些实施方案中，根据本公开内容治疗/预防的癌症选自:实体瘤、血液恶性肿瘤、髓系血液恶性肿瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肾癌、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、甲状腺髓样癌、脑/脊髓癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、高级神经胶质瘤、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、胆管癌、胆管癌、骨癌、肉瘤、卵巢癌、宫颈癌、腹膜癌、前列腺癌、尿路上皮癌、神经内分泌癌。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症是原发性癌症。在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症是继发性癌症(即转移)。

254、vegfa/vegfr靶向干预也已被研究用于治疗/预防眼部疾病，如cornel等人，rom jophamol。(2015)59(4):235-242，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，根据本公开内容治疗/预防的疾病/病症选自:眼部疾病、视网膜病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、湿性(即新生血管性)年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、近视性脉络膜新生血管、早产儿视网膜病、新生血管性青光眼、中心性浆液性视网膜病、眼部肿瘤和角膜新生血管。

255、vegfa/vegfr介导的信号传导也与炎症和自身免疫性疾病的病理学有关，如leand kwon，int j mol sci.(2021)22(10):5387，marina et al.，clujul med.(2015)88(3):247-252，ferrara，endocr rev.(2004)25(4):581-611and azimi et al.，neurolsci.(2020)41(6):1459-1465中所述，所有这些均通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，根据本发明待治疗/预防的疾病/病症选自:炎性疾病、自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、多发性硬化症和败血症。

256、vegfa/vegfr介导的信号传导也与运动神经元疾病例如肌萎缩侧索硬化症的病理学有关，例如文献中所述lambrechts等，nat genet.(2003)34(4):383-94。在一些实施方案中，根据本公开要治疗/预防的疾病/病症是运动神经元疾病或肌萎缩侧索硬化症。

257、根据本公开的各个方面，提供了用于抑制vegfa和vegfr(即vegfa受体，例如vegfr1)之间的相互作用和/或抑制vegfa/vegfr介导的信号传导或包括(例如，在如本文所述的治疗/预防性干预的背景下)的方法。

258、还提供了用于此类方法的根据本公开的试剂，以及根据本公开的试剂在制造用于此类方法的组合物(例如药物)中的用途。在一些实施例中，根据本公开的治疗/预防性干预可以被描述为与前一段中描述的一种或多种效果“相关”。技术人员能够使用本领域常规实践的技术容易地评估这些性质。

259、本公开的制品的施用优选以“治疗有效”或“预防有效”量，这足以显示对受试者的治疗或预防益处。实际施用量以及施用速率和时程将取决于疾病/病症的性质和严重性以及所施用的特定制品。治疗处方，例如剂量等的决定，在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常考虑待治疗的疾病/病症、患者的病症。个体受试者、给药部位、给药方法和从业者已知的其他因素。上述技术和方案的示例可以在雷明顿的《药学科学与实践》(a.adejare编)，第23版(2020年)，学术出版社中找到。

260、施用可以单独或与其他治疗组合，同时或顺序施用，取决于待治疗的病症。本文所述的抗原结合分子或组合物和治疗剂可以同时或依次施用。

261、同时施用是指将本公开内容的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物与其他治疗剂一起施用，例如作为包含两种试剂的药物组合物(即，在组合制剂的情况下)，或在彼此之后立即施用，并且任选地通过相同的施用途径，例如至同一动脉、静脉或其他血管。顺序施用是指施用一种药剂，然后在给定的时间间隔后单独施用另一种药剂。它不是需要两种药剂通过相同途径施用，尽管在一些实施方案中是这种情况。该时间间隔可以是任意时间间隔。

262、可以提供多剂量的抗原结合分子、car、核酸、表达载体、细胞或组合物。一个或多个或每个剂量可以伴随同时或顺序施用另一种治疗剂。多个剂量可以由预定时间间隔分开，该预定时间间隔可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天，或1、2、3、4、5或6个月。举例来说，可以每7、14、21或28天(正负3、2或1天)给予一次剂量。

263、检测方法

264、本公开还提供了用于检测vegfa的方法或用于检测包含/表达vegfa的细胞的方法的本公开的制品。

265、本文描述的抗原结合分子可以用于涉及检测抗原结合分子与vegfa的结合的方法中。这些方法可以涉及抗原结合分子和vegfa的结合复合物的检测。

266、因此，提供了一种方法，包括接触含有或疑似含有vegfa的样品，并检测抗原结合分子和vegfa的复合物的形成。还提供了一种方法，其包括接触含有或疑似含有包含/表达vegfa的细胞的样品，并检测抗原结合分子和包含/表达vegfa的细胞的复合物的形成。

267、合适的方法形式是本领域众所周知的，包括免疫测定法，如夹心测定法，例如酶联免疫吸附试验(elisa)。所述方法可涉及用可检测的片段标记抗原结合分子或靶标或两者，例如本文所述的荧光标记、磷光标记、发光标记、免疫可检测标记、放射性标记、化学、核酸或酶标记。检测技术对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且可以选择与标记剂相对应。

268、包括检测vegfa或包含/表达vegfa的细胞的方法包括用于诊断/预测其中病理学涉及vegfa表达/活性的疾病/病症的方法。

269、这种方法可以在体外对患者样品进行，或者在处理患者样品后进行。一旦收集了样品，进行体外方法时不需要患者在场，因此该方法可能不是在人体或动物体上实施的方法。在一些实施方案中，该方法在体内进行。

270、这些方法可能涉及检测或定量一种或多种:vegfa，包括/表达vegfa的细胞，例如在患者样本中。当该方法包括量化相关因素时，该方法可以进一步包括将所确定的量与作为诊断或预后评估的一部分的标准值或参考值进行比较。其他诊断/预后测试可与本文描述的测试一起使用，以提高诊断或预后的准确性，或确认使用本文描述的测试获得的结果。

271、样品中的检测可用于疾病/病症(例如癌症)的诊断、对疾病/病症的倾向，或用于提供疾病/病症(例如本文所述的疾病/病症)的预后(预测)。诊断或预后可能与现有的(先前诊断的)疾病/状况有关。

272、样品可以取自任何组织或体液。样品可以包含或可以源自:一定量的血液；一定量的源自个体血液的血清，其可能包含去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的液体部分；组织样本或活检；胸膜液；脑脊液(csf)；或从所述个体分离的细胞。在一些实施方案中，样品可以获自或源自受疾病/病症影响的一个或多个组织(例如，其中表现出疾病症状的一个或多个组织，或者参与疾病/病症发病机制的组织)。

273、本公开还提供了选择/分层受试者用vegfa靶向药物治疗的方法。在一些实施例中，根据本公开选择受试者进行治疗/预防，或者基于vegfa的检测/定量或包含/表达vegfa的细胞，例如在从个体获得的样品中，将受试者确定为将受益于此类治疗/预防的受试者。

274、受试者

275、根据本公开的受试者可以是任何动物。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者可以是人类。在一些实施方案中，受试者可以是非人类动物，例如非人类哺乳动物。受试者可以是男性或女性。

276、受试者可以是患者。患者可能患有本文描述的疾病/病症。受试者可能已被诊断患有本文所述的疾病/病症，可能怀疑患有本文所述的疾病/病症，或可能处于发展本文所述的疾病/病症的风险中。

277、可以基于本文描述的疾病/病症的标志物的表征来选择受试者/患者用于根据本公开的治疗/预防。

278、在根据本公开的一些实施方案中，受试者优选是人类受试者。在一些实施方案中，根据本公开的治疗或预防方法治疗的受试者是患有本文所述的疾病或处于发生本文所述的疾病的风险的受试者。

279、试剂盒

280、在本公开的一些方面中，提供了一套试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可具有至少一个容器，所述容器装有预定量的本文所述的抗原结合分子、核酸、表达载体、细胞或组合物。

281、在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于产生本文所述的抗原结合分子、核酸、表达载体、细胞或组合物的材料。

282、试剂盒可以提供抗原结合分子、核酸、表达载体、细胞或组合物，连同向患者施用以治疗特定疾病/病症的说明。

283、根据本公开的试剂盒可以包括使用说明书，例如以说明书或传单的形式。该说明可以包括用于执行本文描述的任何一种或多种方法的方案。

284、序列同一性

285、如本文所用，“序列一致性”是指在比对序列并在必要时引入间隙后，主体序列中与参考序列中的核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸残基的百分比，以实现序列之间最大百分比的序列一致性。

286、为了确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的百分比序列同一性的目的的成对和多重序列比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件例如clustalomega(soding，j.，bioinformatics(2005)21，951-960)，t-coffee(notredame etal.，j.mol.biol.(2000)302，205-217)，kalign(lassmann andsonnhammer，bmc bioinformatics(2005)6，298)

287、25and mafft(katoh and standley，molecular biology and evolution(2013)30(4)772-780)。使用此类软件时，默认参数，例如对于空位罚分和延伸罚分，优选使用。

288、序列

289、

290、

291、本公开包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合明显不允许或明确避免。

292、本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。

293、现在将参考附图通过示例的方式说明本公开的方面和实施例。其他方面和实施例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。

294、贯穿本说明书，包括所附的权利要求书，除非上下文另有要求，词语“包含”以及诸如“包含”和“包含”的变体将被理解为暗示包括所规定的整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。

295、必须注意的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。范围在本文中可以表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或到另一特定值。类似地，当通过使用先行词“大约”将值表达为近似值时，将理解该特定值形成另一个实施例。

296、当本文公开核酸序列时，还明确考虑了其反向互补序列。

297、本文描述的方法可以优选在体外进行。术语“体外”旨在涵盖用培养细胞进行的程序，而术语“体内”旨在涵盖使用/在完整多细胞生物体上进行的程序。

技术实现思路