IL-15的制作方法

il-15融合蛋白以及制备和使用其的方法
1.相关申请的交叉参考
2.本技术要求
2021
年2月5日递交的美国临时申请号
63/146,242
的优先权和权益，所述申请的内容通过参考以其全部结合至本文中
。
3.通过参考结合的序列表
4.以电子方式随附提交的文本文件的内容通过参考以其全部结合至本文中：序列表的计算机可读格式副本
(
文件名：
sbti-002-001wo_seqlist_st25.txt
，记录日期：
2022
年1月
31
日，文件大小
145
千字节
)。
5.背景
6.癌症为发达国家死亡的主要原因之一
。
仅在美国，估计就有
180
万人新近得到诊断，并且
2020
年就发生了超过
600,000
例癌症死亡
。
在癌症中，受试者的细胞异常地生长和分裂，扩散到周围组织中
。
每种癌症均被认为具有基因变化的组合，其可能在癌症之间不同，允许癌细胞逃离身体对细胞增殖的自然控制，并允许癌症扩散
。
尽管一些癌症目前为可治疗的，但许多癌症不是
。
本公开提供用于治疗癌症的重组融合蛋白，其包含对
ctla-4
有特异性的抗原结合结构域
、
白细胞介素
15
受体亚基
α
链
(il-15ra)sushi
结构域和白细胞介素
15(il-15)
，以及包含所述融合蛋白的组合物
。
7.概述
8.本公开基于以下发现：包含与
il-15
和
il-15ra sushi
结构域组合的抗
ctla-4
抗原结合结构域的重组融合蛋白可被用于通过有效地促进免疫细胞的活性和增殖来治疗癌症，所述免疫细胞对由癌细胞表达的癌症抗原作出反应，并对癌症产生免疫反应
。
出乎意料地，包含抗
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
的本公开融合蛋白在体内显示出干扰素
γ
(ifn
γ
)
的有限诱导，同时保持扩增
cd8
和
nk
细胞群的能力，所述干扰素
γ
为被认为在临床研究中对
il-15
的安全性和耐受性产生负面影响的炎性细胞因子
。
9.因此，本公开提供包含以下的重组融合蛋白：
(a)
白细胞介素
15(il-15)
结构域；
(b)
白细胞介素
15
受体亚基
α
(il-15ra)sushi
结构域；和
(c)
细胞毒性
t
淋巴细胞相关蛋白
4(ctla-4)
抗原结合结构域
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域和
il-15ra sushi
结构域被
10.ggggsggggsggggsggggs(seq id no:15)
接头分开
。
11.在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，
il-15
结构域为活性的
。
在一些实施方案中，与缺乏
il-15ra sushi
结构域的在其他方面等同的重组融合蛋白中的
il-15
结构域的活性相比较，
il-15ra sushi
结构域增加
il-15
结构域的活性
。
12.在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，
il-15
结构域包含
seq id no:1
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域包含
seq id no:1
的序列或基本上由其组成
。
13.在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域包含
seq id no:2
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域包含
seq id no:2
的序列或基本上由其组成
。
15ra sushi
结构域和
il-15
结构域包含
seq id no:16
的序列
。
19.在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含含有
seq id no:9
的轻链序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含含有
seq id no:9
的轻链序列
。
20.本公开提供包含以下的重组融合蛋白：
(a)
从
n-到
c-末端含有第一
ctla-4
抗体重链
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的序列的第一多肽；
(b)
含有第二
ctla-4
重链序列的第二多肽；和
(c)
含有
ctla-4
抗体轻链序列的两种另外的多肽
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域和
il-15ra sushi
结构域被
ggggsggggsggggsggggs(seq id no:15)
接头分开
。
21.在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，第一和第二多肽优先地形成异二聚体
。
22.在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，第一多肽包含
seq id no:16
的序列，第二多肽包含
seq id no:10
的序列，和
ctla-4
抗体轻链包含
seq id no:9
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在本公开重组融合蛋白的一些实施方案中，第一多肽包含
seq id no:16
的序列，第二多肽包含
seq id no:10
的序列，和
ctla-4
抗体轻链包含
seq id no:9
的序列
。
23.本公开提供编码本公开重组融合蛋白的多核苷酸
。
24.本公开提供编码本公开的第一多肽
、
第二多肽或
ctla-4
抗体轻链的多核苷酸
。
25.在本公开多核苷酸的一些实施方案中，编码
ctla-4
抗体轻链的序列包含
seq id no:17
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，编码第一多肽的序列包含
seq id no:18
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，编码第二多肽的序列包含
seq id no:19
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
26.本公开提供包含本公开多核苷酸的载体
。
27.在本公开载体的一些实施方案中，载体包含可操作地连接于编码重组融合蛋白或多核苷酸的序列的启动子
。
28.本公开提供包含本公开的重组融合蛋白和药学上可接受的载剂
、
稀释剂或赋形剂的药用组合物
。
29.在本公开药用组合物的一些实施方案中，药用组合物适合于胃肠外给予
。
在一些实施方案中，胃肠外给予包括静脉内输注或注射或者皮下注射
。
30.本公开提供治疗患有疾病或障碍的受试者的方法，其包括给予治疗有效量的本公开重组融合蛋白或药用组合物
。
31.在本公开方法的一些实施方案中，疾病或障碍为癌症
。
在一些实施方案中，癌症包括实体肿瘤或液体肿瘤
。
在一些实施方案中，液体肿瘤包括白血病
、
急性髓系白血病
、
骨髓瘤
、
急性髓性白血病
(aml)、
急性成淋巴细胞性白血病
(all)、
淋巴瘤
、
霍奇金淋巴瘤
、
非霍奇金淋巴瘤
、
β-细胞淋巴瘤
、
慢性淋巴细胞白血病
、
慢性髓性白血病
、
套细胞淋巴瘤
、
滤泡性淋巴瘤
、t-细胞淋巴瘤
、nk-细胞淋巴瘤
、b-细胞淋巴瘤或
nkt-细胞淋巴瘤
。
在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤
、
肾细胞癌
、
间皮瘤
、
小细胞肺癌
、
葡萄膜黑色素瘤
、
膀胱癌
、
胃癌
、
头颈部鳞状细胞癌
、
皮肤癌
、
非小细胞肺癌
、
结直肠癌
、
前列腺癌
、
卵巢癌
、
宫颈癌
、
子宫内膜
癌
、
乳腺癌
、
胰腺癌
、
尿路上皮癌
、
肝细胞癌
、
食管癌
、
成胶质细胞瘤
、
神经胶质瘤或肉瘤
。
在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤和肾细胞癌
。
32.在本公开方法的一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物抑制
ctla-4
对免疫细胞的活性
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物增加白细胞介素
2/
白细胞介素
15
受体
β
(il-2rb)/
共有
γ
链
(il-2rg)
受体复合物对免疫细胞的活性
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物促进免疫细胞中的活性
。
在一些实施方案中，活性包括激活
、
增殖或其组合
。
在一些实施方案中，免疫细胞为
t
细胞
、b
细胞或
nk
细胞
。
在一些实施方案中，
t
细胞为
cd8+t
细胞
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物增加
nk
细胞的增殖
。
33.在本公开方法的一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物胃肠外给予
。
在一些实施方案中，胃肠外给予包括静脉内输注或注射或者皮下注射
。
34.在本公开方法的一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物缓解癌症的体征或症状
。
在一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物抑制癌症的进展
。
在一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物预防癌症或延缓其的复发
。
在一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物诱导癌症的部分或完全缓解
。
35.在本公开方法的一些实施方案中，方法包括一种或多种另外的癌症疗法
。
在一些实施方案中，一种或多种另外的癌症疗法包括化学疗法
、
小分子抑制剂
、
基于蛋白的疗法或生物疗法
、
放射疗法
、
手术
、
免疫疗法或过继细胞疗法
。
在一些实施方案中，过继细胞疗法包括嵌合抗原受体
(car)t
细胞疗法
、t
细胞受体
(tcr)t
细胞疗法或
car nk
细胞疗法
。
36.在本公开方法的一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物基本上不增加来自受试者的外周血样品中干扰素
γ
(ifn
γ
)
的水平
。
在一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物与给予等摩尔量的
il-15
或呈与
il-15ra sushi
结构域的复合物的
il-15
相比增加的来自受试者的外周血样品中干扰素
γ
(ifn
γ
)
的水平更少
。
在一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物增加免疫细胞的增殖，但基本上不增加受试者体内
ifn
γ
的水平
。
在一些实施方案中，免疫细胞包括
nk
细胞
、cd8+t
细胞或其组合
。
37.在本公开方法的一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物导致
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1
或
10:1。
38.在本公开方法的一些实施方案中，给予重组融合蛋白或药用组合物与给予等摩尔量的
il-15
或呈与
il-15ra sushi
结构域的复合物的
il-15
相比导致更低的毒性
。
39.在本公开方法的一些实施方案中，重组融合蛋白以
0.1
μ
g/kg-1mg/kg
的剂量给予
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白以
10
μ
g/kg-0.30mg/kg
的剂量给予
。
40.在本公开方法的一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物静脉内
、
瘤内或皮下给予
。
41.在本公开方法的一些实施方案中，每天
、
每2天
、
每3天
、
每4天
、
每5天
、
每6天
、
每7天
、
每8天
、
每9天
、
每
10
天
、
每两周
、
每三周或每月给予所述重组融合蛋白或药用组合物
。
42.在本公开方法的一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物给予至少1周
、
至少2周
、
至少3周
、
至少4周
、
至少5周
、
至少6周
、
至少2个月
、
至少3个月
、
至少4个月
、
至少5个月或至少6个月
、
至少8个月
、
至少
10
个月
、
至少
12
个月
、
至少
14
个月
、
至少
16
个月
、
至少
18
个月
、
至少
20
个月
、
至少
22
个月或至少2年
。
43.本公开提供用于在受试者中治疗疾病或障碍的方法的本公开的重组融合蛋白或药用组合物
。
44.本公开提供用于制造用于在受试者中治疗疾病或障碍的药物的本公开的重组融合蛋白
。
45.本公开提供制备本公开重组融合蛋白的方法，其包括：
(a)
使多个细胞与本公开的多核苷酸或载体接触；
(b)
由多个细胞表达重组融合蛋白；和
(c)
纯化重组融合蛋白
。
46.本公开提供试剂盒，其包含治疗有效量的本公开重组融合蛋白
、
多核苷酸
、
载体或药用组合物
。
47.附图简述
48.当结合附图时，通过参考以下详细描述和所附权利要求，本发明的各种目的和优点以及更完整的理解为显而易见的并且更易于意识到，其中：
49.图
1a-1e
各自为显示本公开的
ctla-4
抗体和示例性
ctla-4-抗体融合蛋白的一系列图解
。
50.图2为比较抗
ctla-4、il-15ra sushi
结构域
、il-15
融合蛋白和
her3
抗体-神经调节蛋白1融合蛋白的两种
fc
变体的热稳定性的表
。wt
：融合蛋白的杵重链具有
s366w
取代，和臼重链具有
y407t
取代
。wsav
：杵重链具有
s366w
取代，和臼重链具有
t366s、l368a
和
y407v
取代
。
51.图3为显示在与
il-15ra sushi
结构域和
il-15
融合的恒定区中具有“臼”修饰的
ctla-4
抗体重链
、
在恒定区中具有“杵”修饰的
ctla-4
抗体重链以及
ctla-4
抗体轻链的表达载体的构建的图解
。
52.图4为显示抗
ctla-4
抗体
(
伊匹单抗
(ipilimumab))
和图
1a
所示设计的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白与源于不同物种的
ctla-4
的结合交叉反应性的一系列曲线图
。
α
ctla-4-il-15ra-il-15
：抗
ctla-4、il-15ra sushi
结构域
、il-15
融合蛋白
。
53.图5为显示通过在细胞共培养测定系统中阻断
ctla-4
受体功能诱导白细胞介素
2(il-2)
分泌的曲线图
。
α
ctla-4-il15ra-il-15
：抗
ctla-4
，
il-15ra sushi
结构域
、il-15
融合蛋白
。
54.图6为显示抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(seq id no:9、10
和
16)
与
ctla-4
抗体相比较的抗体依赖性细胞毒性的曲线图
。
55.图7为显示抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白与白细胞介素2受体
β
亚基
(il2r
β
)
的结合活性的曲线图
。
56.图
8a-b
为显示野生型
(
图
8a)
和
il15r
α
缺陷型
(
图
8b)t
细胞响应于用抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白刺激而增殖的一对曲线图
。
α
ctla-4-il-15ra-il-15
：抗
ctla-4、il-15ra sushi
结构域
、il-15
融合蛋白；
α
ctla-4-il-15
：
ctla-4
抗体与
il-15
融合，无
il-15ra sushi
结构域，如图
1a
所示
。
57.图
9a-9d
各自为显示野生型
(ctll2-wt
，图
9a
和
9c)
和
il15r
α
缺陷型
(ctll2-il15rako
，图
9b
和
9d)t
细胞响应于用各种本公开的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合构建体刺激而增殖的曲线图
。
构建体示意图如图
1b-1e
所示
。
图
9d
中的
bs3
臼是指具有图
1e
所示的
bs3
结构，但具有与
il-15ra-sushi_il-15
融合的两条臼重链而不是杵和臼重链的构建体
。
58.图
10a-10c
各自为显示在
c57bl/6
小鼠体内
nk
细胞和
cd8
+
t
细胞响应于给予抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白的增殖的一对曲线图
。
α
ctla-4-il-15ra-il-15
：
ctla-4
抗体与
il-15ra il-15ra sushi
结构域和
il-15
融合；
α
ctla-4-il-15
：
ctla-4
抗体与
il-15
融合，无
sushi
结构域
。
59.图
11
为显示在食蟹猴体内
nk
细胞
、cd8
+
t
细胞和
cd4
+
t
细胞响应于用抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(
具有
seq id no:9、10
和
16)
处理而扩增的一系列曲线图
。
60.图
12
为显示食蟹猴体内细胞因子响应于给予抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白的诱导的曲线图
。y
轴上的单位为皮克
(pg)
每毫升
(ml)。
在给予之前3天
(d-3)
，并且然后在每周一次的4周重复给药毒理学研究中在第一次给予之后2小时
、24
小时和
48
小时
(
分别为
d1(2h)、d1(24h)
和
d1(48h))
，并且再次在每周一次的4周重复给药毒理学研究中在第四次给药之后2小时
、24
小时和
48
小时
(
分别为
d22(2h)、d22(24h)
和
d22(48h))
，测定细胞因子水平
。
61.图
13a
为显示在表达人类
ctla-4
和携带
mc38
异种移植肿瘤的小鼠中用抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(
具有
seq id nos:9、10
和
16)
治疗后的抗肿瘤活性的一对曲线图
。
62.图
13b
为显示在表达人类
ctla-4
和荷载
b16f10
异种移植肿瘤的小鼠中用抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(
具有
seq id nos:9、10
和
16)
治疗后的抗肿瘤活性的一对曲线图
。
63.详述
64.白细胞介素-15(il-15)
为在淋巴细胞的发育
、
存活
、
增殖和激活中发挥作用的共有
γ
链细胞因子，所述淋巴细胞包括：自然杀伤
(nk)
细胞，
t
细胞比如
cd8+
αβ
t
细胞
、
γδ
t
细胞和
nkt
细胞，以及上皮内
t
淋巴细胞
。il-15
与
il-2
共具共有的受体
γ
链，并具有相似的生物效应
。il-15
在细胞中与第二多肽
il-15
受体
α
(il-15r
α
)
共同产生，并且这两种蛋白形成稳定的异二聚体，后者被转运到质膜，在那里
il-15r
α
将可溶性异二聚体释放到细胞外空间和血浆循环中
。
65.与
il-2
不同，
il-15
已经显示出促进细胞毒性免疫反应而不会还促进激活诱导的细胞死亡，这是一种借以通过消除自身反应性
t
细胞来降低自身免疫性风险的机制
。
在小鼠癌症模型中，已经显示给予
il-15
增强
cd8+t
细胞的体内抗肿瘤活性，并延长存活
。
不希望受到理论的束缚，认为
il-15
诱导淋巴细胞进入到肿瘤中，并增加其细胞毒性，以及影响增殖和稳态
。
因此，重组
il-15
，无论是作为单体还是作为可溶性异二聚体，均为作为癌症治疗剂的具有吸引力的靶标
。
66.然而，给予重组
il-15
，无论是作为单体还是作为异二聚体，均与显著毒性有关
。
通过每天静脉内团注向人类癌症患者给予重组人类
il-15
导致了
il-6、il-8
和
ifn
γ
以及
il-10、
肿瘤坏死因子
α
和
il-1
β
的水平显著升高
。
这些增加与临床毒性比如发热
、
发冷
、
僵硬和血压变化一致，导致研究作者得出结论，重组人类
il-15
太难以作为静脉内团注剂量给予
(conlon
等人
(2015)journal ofclinical oncology 33:74-82)。
类似地，当将与
il-15r
α
复合的
il-15
给予小鼠时，观察到显著毒性，包括体温过低
、
体重减轻
、
急性肝损伤和死亡
(guo
等人
(2015)j immunol 1953:2353-2364)。il-15/il-15r
α
异二聚体的毒性作用似乎主要地由
nk
细胞的扩增和激活介导，而
nk
细胞的扩增和激活又是由于给予
il-15/il-15r
α
异二聚
体后发生的干扰素
γ
(ifn
γ
)
的表达增加引起的
。
类似地，在一项递增剂量研究中，当
14
名患有转移性或不可切除实体瘤的患者用
il-15-il-15ra
异二聚体治疗时，在3名患者观察到严重不良事件，并且包括大疱性皮炎
、
紫癜和急性肾损伤
(conlon
等人
j.immunother cancer 2021,9:e003388)。
还观察到包括
ifn
γ
在内的几种细胞因子的诱导，并且
ifn
γ
的倍数增加超过所测量的所有其他细胞因子的倍数增加
。
67.因此，与上述重组
il-15
或与
il-15r
α
复合的
il-15
相比较，存在对具有降低毒性的改进的基于
il-15
的治疗的需要
。
发明人已出乎意料地发现，与
il-15r
α
sushi
结构域融合的
il-15
在也与
ctla-4
抗原结合结构域融合时不会导致
ifn
γ
的水平增加
。
因此，本公开提供包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15r
α
sushi
结构域和
il-15
的融合蛋白，其与本领域已知的重组人类
il-15
或
l-15/il-15r
α
异二聚体相比较具有优异的安全性和保留的药效学活性
。
68.细胞毒性
t
淋巴细胞相关蛋白
4(ctla-4)
为跨膜受体，其作为免疫检查点起作用并下调免疫反应
。ctla-4
与
cd28
同源，
cd28
为
t
细胞激活的关键
t
细胞共刺激受体
。ctla-4
和
cd28
分子两者均可以竞争方式与抗原呈递细胞上的
cd80
和
cd86
结合，从而调节免疫反应，其中
ctla-4
向
t
细胞传递抑制性信号，而
cd28
传递刺激性信号
。ctla-4
以比
cd28
更大的亲和性结合
cd80
和
cd86
，从而使得其可与
cd28
竞争其配体而胜出
。ctla-4
在调节性
t
细胞中组成性表达，但在激活之后仅于效应
t
细胞中上调
。
抗
ctla-4
抗体伊匹单抗为由
fda
批准的第一种用于癌症的免疫检查点抑制剂疗法
。
尽管进行了深入研究，但伊匹单抗借以发挥其免疫治疗作用的分子机制仍然是争论的主题
。
尽管初始前提为抗
ctla-4
抗体通过阻断抑制性信号进入到效应
t
细胞中而起作用，但最近的研究表明，伊匹单抗的体内抗肿瘤活性可归因于通过
adcc
机制的调节性
t
细胞耗竭
(simpson t.r.
等人，
2013,j.exp.med.210(9):1695-1710
；
du x.
等人，
2018,cell research 0:1-15)。
不希望受到理论的束缚，认为
il-15
可通过其扩增
cd8 t
细胞和
nk
细胞的能力来增强
ctla-4
抗体耗竭调节性
t
细胞的能力
。
69.因此，本文提供重组融合蛋白，其包含与细胞毒性
t
淋巴细胞相关蛋白
4(ctla-4
，也被称为
cd152)、
白细胞介素
15
受体
α
链
(il-15ra
或
il-15r
α
)
的
sushi
结构域和白细胞介素
15(il-15)
结合的抗体
。
本文提供编码这些重组融合蛋白的多核苷酸和载体，以及包含重组融合蛋白的药用组合物，以及制备和使用它们的方法
。
重组融合蛋白可被用于治疗包括癌症在内的多种疾病和障碍
。
70.定义
71.除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义
。
72.出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当的情况下，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然
。
在以下阐述的任何定义与通过参考结合至本文中的任何文件冲突的情况下，以下文阐述的定义为准
。
73.如本文使用的，术语“活性物
(active)”是指具有生物活性或生物功能的片段
。
在一些实施方案中，活性等于或接近野生型蛋白的活性
。
74.如本文使用的，术语“受试者”包括但不限于：哺乳动物，包含例如人类
、
非人灵长类
(
例如猴
)、
小鼠
、
猪
、
牛
、
山羊
、
兔
、
大鼠
、
豚鼠
、
仓鼠
、
马
、
猴
、
绵羊或其他非人哺乳动物；非哺乳动物，包含例如非哺乳类脊椎动物，比如鸟
(
例如鸡或鸭
)
或鱼，以及非哺乳类无脊椎动物
。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物被用于治疗
(
预防性地和
/
或治疗性地
)
非人
动物
。
术语“受试者”还可指患者，即等待或接受医学护理的个体
。
75.本文中的术语“药用组合物”意指适合于在包括动物或人类在内的受试者中用于药用用途的组合物
。
药用组合物通常包含有效量的活性剂
(
例如本发明的重组融合蛋白
)
和药学上可接受的载剂
、
稀释剂或赋形剂
(
例如缓冲剂
、
佐剂等
)。
76.术语“有效量”意指足以产生期望结果的剂量或量
。
期望的结果可包括剂量或量的接受者的客观或主观改善
(
例如长期存活
、
肿瘤数量和
/
或大小的减少
、
疾病状态的有效预防等
)。
[0077]“预防性治疗”为给予不显示疾病
、
病状或医学障碍的体征或症状或者仅显示疾病
、
病状或障碍的早期体征或症状的受试者的治疗，以使得治疗是出于减少
、
预防或降低发展为疾病
、
病状或医学障碍风险的目的而给予的
。
预防性治疗作为针对疾病或障碍的预防性治疗起作用
。“预防性活性”为诸如本发明的重组融合蛋白或其组合物等药剂的活性，所述药剂当被给予至不显示病状
、
疾病或障碍的体征或症状
(
或仅显示病状
、
疾病或障碍的早期体征或症状
)
的受试者时，减少
、
预防或降低受试者发展为病状
、
疾病或障碍的风险
。“预防上有用的”药剂或化合物
(
例如本发明的重组融合蛋白
)
是指可用于减少
、
预防
、
治疗或降低病状
、
疾病或障碍的发展的药剂或化合物
。
[0078]“治疗性治疗”为给予显示病状
、
疾病或障碍的症状或体征的受试者的治疗，其中出于减少或消除病状
、
疾病或障碍的那些体征或症状的目的而给予受试者治疗
。“治疗性活性”为诸如本发明的重组融合蛋白或其组合物等药剂的活性，所述药剂当被给予至患有这种体征或症状的受试者时消除或减少病状
、
疾病或障碍的体征或症状
。“治疗上有用的”药剂或化合物
(
例如本发明的重组融合蛋白
)
表明药剂或化合物可用于减少
、
治疗或消除病状
、
疾病或障碍的这种体征或症状
。
[0079]
除非另外指明，否则如本文使用的术语“治疗癌症”意指在受试者中部分或完全地逆转
、
缓解
、
抑制其进展或预防肿瘤生长
、
肿瘤转移或者其他致癌或肿瘤细胞
。
除非另外指明，否则如本文使用的术语“治疗”是指治疗的行为
。
[0080]
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性百分比”是指当进行比较和比对以获得最大对应性时为相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列
。
为确定同一性百分比，将序列进行比对以用于最佳比较的目的
(
例如可在第一氨基酸序列或核酸的序列中引入空位，以与第二氨基或核酸序列进行最佳比对
)。
然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸
。
当第一序列中的位置由与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置为相同的
。
两个序列之间的同一性百分比为由序列共具的相同位置数量的函数
(
即％同一性等于相同位置的数量
/
位置总数
(
例如重叠位置
)
×
100)。
在一些实施方案中，两个序列为相同长度
。
[0081]
在两种核酸或多肽的上下文中，术语“基本上相同的”是指具有至少
80
％
、
至少
81
％
、
至少
82
％
、
至少
83
％
、
至少
84
％
、
至少
85
％
、
至少
86
％
、
至少
87
％
、
至少
88
％
、
至少
89
％
、90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％同一性或至少
99
％同一性
(
例如如使用以下阐述的方法之一确定的
)
的两种或更多种序列或子序列
。
[0082]
可使用数学算法完成两个序列之间同一性百分比的确定
。
用于比较两个序列的数
学算法的非限制性实例为
karlin
和
altschul,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:2264-2268
的算法，如在
karlin
和
altschul,1993,proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877
中改进的
。
此种算法被结合到
altschul
等人，
1990,j.mol.biol.215:403-410
的
nblast
和
xblast
程序中
。
可用
nblast
程序，得分＝
100
，字长＝
12
来进行
blast
核苷酸检索，以得到与编码感兴趣蛋白的核酸同源的核苷酸序列
。
可用
xblast
程序，得分＝
50
，字长＝3来进行
blast
蛋白检索，以得到与感兴趣蛋白同源的氨基酸序列
。
为获得用于比较目的的空位比对，可如
altschul
等人，
1997,nucleicacidsres.25:3389-3402
所述使用空位
blast。
可替换的，可使用
psi-blast
进行迭代检索，其检测分子之间的远缘关系
(distant relationship)(
同上
)。
当利用
blast、
空位
blast
和
psi-blast
程序时，可使用各自程序
(
例如
xblast
和
nblast)
的默认参数
。
用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例为
myers
和
miller
，
cabios(1989)
的算法
。
此种算法被结合到
align
程序
(
版本
2.0)
中，该程序为
gcg
序列比对软件包的一部分
。
当利用
align
程序用于比较氨基酸序列时，可使用
pam120
权重残基表，空位长度罚分为
12
和空位罚分为
4。
用于序列分析的另外算法为本领域已知的，并且包括如
torellis
和
robotti,1994,comput.appl.biosci.10:3-5
所述的
advance
和
adam
；以及
pearson
和
lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:2444-8
所述的
fasta。
可替换的，可使用如
higgins
等人，
1996,methodsenzymol.266:383-402
所述的
clustal w
算法进行蛋白序列比对
。
[0083]
如本文使用的，术语“结合”、“特异性地结合至”或“对
……
有特异性的”是指可测量和可再现的相互作用，比如靶标与抗体之间的结合，其在存在包括生物分子在内的分子的异质群体的情况下确定靶标的存在
。
例如，与靶标
(
其可为表位
)
特异性地结合的抗体为以比其与其他靶标结合更大的亲和性
、
亲合力
、
更容易和
/
或更长的持续时间结合该靶标的抗体
。
在一个实施方案中，抗体与不相关靶标结合的程度小于抗体与靶标结合的约
10
％，如例如通过放射免疫测定
(ria)
测量的
。
在某些实施方案中，与靶标特异性地结合的抗体具有
《1
μμ
、《100nm、《10nm、《1nm
或
《0.1nm
的解离常数
(kd)。
[0084]
在某些实施方案中，抗体与在来自不同物种的蛋白中保守的蛋白上的表位特异性地结合
。
在另一个实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合
。
[0085]
除非上下文另外明确规定，否则如本说明书中使用的单数形式“一个
(a)”、“一种
(an)”和“该
(the)”包括复数参考物
。
对“制剂”或“方法”的提及包括本文所述类型和
/
或在阅读本公开后对于本领域技术人员将变为显而易见的一种或多种制剂
、
方法和
/
或步骤
。
[0086]
术语“多肽”是指氨基酸的聚合物及其等同物而不指特定长度的产物；因此，“肽”和“蛋白”被包括在多肽的定义内
。
蛋白可具有一个或多个多肽
。
多肽的定义内还包括如本文定义的“抗体”。“多肽区”是指多肽的区段，其区段可含有例如一个或多个结构域或基序
(
例如抗体的多肽区可含有例如一个或多个互补决定区
(cdr))。
术语“片段”是指多肽的一部分，其小于如其天然存在的整个多肽
。
[0087]
除非上下文另外指明，否则“衍生物”为相对于第二多肽具有一个或多个非保守或保守氨基酸取代的多肽或其片段
(
也被称为“变体”)
；或者通过共价连接第二分子比如通过连接异源多肽或者通过糖基化
、
乙酰化
、
磷酸化等进行修饰的多肽或其片段
。“衍生物”的定义内进一步包括例如含有一种或多种氨基酸类似物
(
例如非天然氨基酸等
)
的多肽
、
具有未取代连接以及本领域已知的天然和非天然存在的其他修饰的多肽
。
[0088]“分离的”多肽为已从其天然环境的组分中鉴定和分离和
/
或回收的多肽
。
其天然环境的污染物组分为会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶
、
激素和其他蛋白或非蛋白溶质
。
分离的多肽包括分离的抗体或其片段或衍生物
。
[0089]
t
细胞为在其细胞表面表达
t
细胞受体
(tcr)
并且在适应性免疫反应中发挥核心作用的淋巴细胞类型
。t
细胞由骨髓中的造血干细胞产生，并迁移到胸腺中以成熟
。t
细胞的类型包括
cd4+
辅助性
t
细胞
、
细胞毒性
t
细胞
、
记忆性
t
细胞和
nkt
细胞
。t
细胞的类型通过它们表达标记物比如
cd4、cd8
和
cd45ro
的组合而对本领域普通技术人员将为容易显而易见的
。
[0090]
自然杀伤
(nk)
细胞为在先天免疫反应中发挥作用的细胞毒性淋巴细胞类型
。
在不存在抗体和
/
或主要组织相容性复合体
(mhc)
表达的情况下，
nk
细胞可识别并杀伤应激细胞，产生快速免疫反应
。
另外，与抗原结合的抗体可由
nk
细胞上表达的
fc
γ
riii(cd16)
受体识别，导致
nk
激活
、
溶细胞颗粒释放和细胞凋亡
。
与
t
细胞一样，
nk
细胞分化自造血干细胞
。nk
细胞通过其标记物或标记物组合
(
例如
cd56+
和
cd3-)
的表达而对本领域普通技术人员将为显而易见的
。
[0091]
激活
t
细胞和
nk
细胞意指诱导其生物状态的变化，籍此细胞表达激活标记物
、
产生细胞因子
、
增殖和
/
或对靶细胞变为细胞毒性的
。
[0092]
对于
t
细胞，仅
t
细胞受体
(tcr)
的参与通常不足以诱导静息的幼稚或记忆性
t
细胞的持续激活
。
完全的
t
细胞激活需要来自感受态抗原呈递细胞
(apc)
的第二共刺激信号
。
通过
t
细胞上的共刺激细胞表面受体与
apc
表面上适当抗衡受体的相互作用来自然实现共刺激
。apc
通常为宿主来源的细胞，其显示出将引起免疫反应刺激的部分
。apc
包括单核细胞
/
巨噬细胞
、
树突状细胞
、b
细胞和任何数量的病毒感染细胞或肿瘤细胞，所述细胞在其表面表达由
t
细胞识别的蛋白
。
成为免疫原性
apc
还必须在其表面表达共刺激分子
。
此类
apc
能够刺激
t
细胞增殖，诱导细胞因子产生，并在与
t
细胞直接相互作用时充当溶细胞性
t
细胞的靶标
。
[0093]
对于
nk
细胞，激活至少部分地由抑制性和激活受体刺激的平衡决定
。
示例性的激活受体包括
ly49、ncr
受体和
cd16
，而示例性的抑制性受体包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体
(kir)、cd94/nkg2
和
lir。
细胞因子在
nk
细胞激活中发挥作用
。
细胞因子，其由细胞在应激例如感染的应激下释放，
nk
细胞在受影响区域存在病原体
。
参与
nk
激活的细胞因子包括
il-12、il-15、il-18、il-2
和
ccl5。nk
细胞也响应于干扰素或巨噬细胞来源的细胞因子而被激活
。
[0094]b细胞，也被称为b淋巴细胞，为淋巴细胞亚型的白血细胞类型
。
它们通过分泌抗体而在适应性免疫系统的体液免疫组分中起作用
。
[0095]
术语“自体的”是指源于其随后将被重新引入到该个体中的同一个体的任何材料
。
[0096]
术语“同种异体的”是指源于与材料引入的个体同一物种的不同动物的任何材料
。
当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体的
。
在一些方面，来自同一物种个体的同种异体材料可能在遗传上充分不同而在抗原方面相互作用
。
[0097]
如本文使用的，术语“约”在数量方面意指加或减5％，或在另一个实施方案中加或减
10
％，或在另一个实施方案中加或减
15
％，或在另一个实施方案中加或减
20
％
。
[0098]
本文描述的所有方法均可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指明或者与上下
文明显矛盾
。
使用本文提供的任何和所有实例或示例性语言
(
例如“比如”)
仅预期更好地说明本发明，并且除非另外要求，否则不对本发明的范围构成限制
。
说明书中的语言均不应被解释为将任何非要求保护的元件指明为对本发明的实践必不可少的
。
[0099]
本说明书中提及的所有出版物
、
专利和专利申请均通过参考结合至本文中，达到好像每个单个出版物
、
专利或专利申请均被具体且单独地指明通过参考结合的相同程度
。
[0100]
重组融合蛋白
[0101]
本公开提供包含白细胞介素
15(il-15)
结构域
、
白细胞介素
15
受体亚基
α
(il-15ra)sushi
结构域和对细胞毒性
t
淋巴细胞相关蛋白
4(ctla-4)
有特异性的抗原结合结构域的重组融合蛋白
。
[0102]
白细胞介素
15(il-15)
[0103]
本公开提供包含白细胞介素
15(il-15)
或其活性片段或衍生物的重组融合蛋白
。
[0104]
il-15
为属于细胞因子家族的免疫调节细胞因子，所述家族包括白细胞介素-2(il-2)、
白细胞介素-4(il-4)、
白细胞介素-7(il-7)、
白细胞介素-9(il-9)
和白介介-21(il-21)。
与
il-2
一样，
il-15
结合至包含
il-2/il-15
受体
β
(il-2r
β
或
il-2rb
，也被称为
cd122)
亚基和共有
γ
链
(
γ
c)(il-2rg
或
cd132)
受体亚基的受体复合物并通过其发出信号
。il-15
具有多种功能，包括但不限于调控
t
细胞反应
、
调控组织修复和b细胞归巢
、
调节炎症和激活
nk
细胞
。il-15
信号传导可刺激一系列下游通路，导致细胞生长增加
、
细胞凋亡减少以及免疫细胞激活和迁移增强
。il-15
也被认为在
nkt
细胞的发育和存活中发挥作用
。il-15
可刺激
t
细胞和
nk
细胞的增殖
、
存活和细胞毒性功能，并诱导细胞毒性淋巴细胞的产生，导致增强抗肿瘤反应
。
[0105]
il-15
为
14-15kda
的糖蛋白
。
人类
il-15
基因包含9个外显子
(1-8
和
4a)
和8个内含子，其中4个
(
外显子
5-8)
编码成熟蛋白
。
已报道了
il-15
的两种可变剪接转录本变体，它们在其细胞运输方面不同，但编码相同的成熟蛋白
。il-15
基因描述于例如
ncbi
记录
ng_029605.2
中，其内容通过参考以其全部结合至本文中
。
[0106]
在一些实施方案中，本文所述重组融合蛋白的
il-15
结构域为活性的
。il-15
活性包括但不限于促进免疫细胞激活
、
促进免疫细胞增殖
、
减少免疫细胞凋亡
、
调控免疫细胞反应
、
调控免疫细胞释放细胞因子和调控免疫细胞分化
。
在一些实施方案中，
il-15
活性包括促进免疫细胞激活
、
促进免疫细胞增殖或其组合
。
在一些实施方案中，免疫细胞包括
t
细胞
、b
细胞
、nk
细胞或其组合
。
[0107]
在一些实施方案中，
il
结构域包含
nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints(seq id no:1)
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域包含
seq id no:1
的序列，或者与其具有至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域包含
seq id no:1
的序列或基本上由其组成
。
[0108]
在一些实施方案中，
il-15
结构域由包含
aattgggtcaacgtgatctccgacctgaagaagatcgaggacctgatccagtccatgcacatcgacgctaccctgtacaccgagtccgacgtgcacccttcctgtaaagtgaccgccatgaagtgctttctgctggaactgcaagtgatctccctggaatccggcgacgcctctatccacgacaccgtggaaaacctgatcatcctggccaacaactccctgtcctccaacggcaacgtgaccgagtctggctgcaaagagt
gcgaggaactggaagagaagaacatcaaagagttcctccagtccttcgtgcacatcgtgcagatgttcatcaacaccagc(seq id no:21)
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％
、
至少
99
％或相同的序列编码
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域由包含
seq id no:21
的序列，或者与其具有至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％
、
至少
99
％或相同的序列编码
。
在一些实施方案中，
il-15
结构域由包含
seq id no:21
的序列编码
。
[0109]
il-15r
α
sushi
结构域
[0110]
本公开提供包含
il-15、il-15ra sushi
结构域和抗
ctla-4
抗体的重组融合蛋白
。
[0111]
白细胞介素
15
受体亚基
α
(il-15r
α
或
il-15ra)
为
il-15
细胞因子受体复合物的关键组分
。il-15r
α
为对
il-15
具有非常高亲和力的跨膜蛋白，其促进
il-15
从内质网
(er)
通过细胞质的运输和
il-15/il-15r
α
复合物在细胞表面的呈递
。
除在整个细胞质和细胞表面表达保持相关之外，
il-15/il-15r
α
还可作为复合物被裂解到细胞外空间中
。il-15
和
il-15r
亚基的这些特性适合于独特的细胞因子递送机制
。
与
il-15
信号传导亚基的选择性表达相反，细胞因子本身和
il-15r
α
由大多数细胞类型广泛表达，所述细胞类型包括造血和非造血细胞两者，但在髓系细胞中最高
。
[0112]
il-15ra sushi
结构域为细胞外蛋白-蛋白相互作用结构域，其含有四个半胱氨酸，以
1-3
和
2-4
模式形成两个二硫键
。
不希望受到理论的束缚，认为
il-15ra sushi
结构域通过经
il-2r
β
/il-2r
γ
异二聚体受体复合物增强
il-15
与免疫细胞的结合和对免疫细胞的作用而充当
il-15
激动剂
。
[0113]
在一些实施方案中，与缺乏
il-15ra sushi
结构域的在其他方面等同的重组融合蛋白中的
il-15
结构域的活性相比较，
il-15ra sushi
结构域增加
il-15
结构域的活性
。
例如，作为本文所述重组融合蛋白的一部分的
il-15ra sushi
结构域的存在可增加
il-15
结构域为其一部分的重组融合蛋白对免疫细胞增殖
、
激活或其组合的作用
。
[0114]
人类
il-15ra
描述于例如
uniprotkb
记录
q13261.1
中，其内容通过参考以其全部结合
。
在一些实施方案中，
il-15ra
包含以下序列：
[0115][0116]
在以上
seq id no:20
中，
sushi
结构域加下划线
。
本领域的普通技术人员将理解，包含在n和c末端相差
1、2、3、4、5
或更多个氨基酸的
sushi
结构域的全部或部分的
il-15ra
片段可具有
sushi
结构域活性，并且被认为处于本发明的范围内
。
[0117]
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域包含
itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecv lnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstv(seq id no:2)
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域包含
seq id no:2
的序列，或者与其具有至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域包含
seq id no:2
的序列或基本上由其组成
。
[0118]
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域由包含
attacatgccctcctccaatgtccgt
ggaacacgccgacatctgggtcaagtcctacagcctgtactccagagagcggtacatctgcaactccggcttcaagagaaaggccggcacctctagcctgaccgagtgcgtgctgaacaaggccaccaatgtggcccactggaccacacctagcctgaagtgcatcagggaccccgctctggttcatcagaggcctgctcctccatctaccgtt(seq id no:22)
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％
、
至少
99
％或相同的序列编码
。
在一些实施方案中，
il-15ra
结构域由包含
seq id no:22
的序列，或者与其具有至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
97
％
、
至少
99
％或相同的序列编码
。
在一些实施方案中，
il-15ra
结构域由包含
seq id no:22
的序列编码
。
[0119]
ctla-4
抗原结合结构域
[0120]
本公开提供包含对
ctla-4
有特异性的抗原结合结构域
(
在本文中有时被称为
ctla-4
抗原结合结构区
)
的融合蛋白
。
设想任何合适的
ctla-4
抗原结合结构域处于本公开的范围内，包括但不限于单链可变片段
(scfv)、
单域抗体
(sdab)
比如
vhh
单域抗体
、
抗体或抗体片段
。
[0121]
人类
ctla-4
，也被称为
cd152
，为免疫球蛋白超家族中膜结合单v结构域亚家族的成员，主要地存在于激活的
t
细胞和调节性
t
细胞上
。t
淋巴细胞
(t
细胞
)
为对抗原的适应性免疫反应的中心
。
完全激活幼稚
t
细胞需要至少两个信号
。
第一抗原特异性信号由
t
细胞受体
(tcr)
与抗原呈递细胞
(apc)
上
mhc/
肽复合物的相互作用提供
。
第二共刺激信号由
t
细胞上的受体与抗原呈递细胞
(apc)
上的其配体之间的相互作用提供
。tcr/mhc
和共刺激相互作用两者的参与导致经由种多细胞内通路激活
t
细胞，并随后激活多种效应化合物的转录因子，包括细胞因子比如
il-2。
这些事件导致
t
细胞增殖
、cd4
+
辅助性
t
细胞
(th)
池的产生以及激活的
cd8
+
细胞毒性
t
细胞的扩增
。
共刺激不仅对完全
t
细胞激活至关重要，而且其在
tcr/mhc
参与期间不存在会导致无能和
/
或细胞凋亡
。
一种关键的相互作用发生在
t
细胞上的
cd28
与
apc
上的
b7-1(cd80)
和
b7-2(cd86)
之间
。cd28
促进
t
细胞分化成
th1
表型细胞并增强通过b细胞的抗体产生和
t
细胞的激活
。
在
t
细胞激活之后，在
t
细胞上作为负调控受体起作用的
ctla-4
上调
。ctla-4
以几种方式抑制免疫反应：其与
cd28
竞争
b7
配体，并从而阻断共刺激；其发出负信号来抑制
t
细胞激活；以及其可通过反式内吞作用从相对细胞捕获
cd80
和
cd86
，导致经由
cd28
的共刺激受损
。ctla-4
作为免疫检查点起作用，并且
ctla-4
的激活导致免疫反应的下调
。
通过拮抗
ctla-4
激活，例如通过使用充当
ctla-4
拮抗剂的对
ctla-4
有特异性的抗原结合结构域，可防止或减少
ctla-4
介导的免疫反应的下调
。
[0122]
在一些实施方案中，对
ctla-4
有特异性的本公开抗原结合结构域可充当
ctla-4
拮抗剂
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗原结合结构域防止或减少
ctla-4
介导的免疫反应下调
。ctla-4
拮抗剂可减少免疫系统例如对癌症和感染的耐受性的发展，并促进免疫细胞的活性
。
例如，
ctla-4
拮抗剂可促进免疫细胞激活和增殖
。
[0123]
在一些实施方案中，对
ctla-4
有特异性的抗原结合结构域为抗体，例如单克隆抗体
。
[0124]
如本文使用的，术语“抗原结合区”是指负责抗原结合部分与抗原之间特异性结合的抗原结合部分的结构域
。
例如，抗体或其片段的抗原结合区由重链
(
本文中被缩写为
vh)
和轻链
(
本文中被缩写为
vl)
的
n-末端可变区的氨基酸残基形成
。vh
和
vl
的可变区各自包含三个高变区，被称为互补决定区
(cdr)。vh
的3个
cdr
和
vl
的3条
cdr
相对于彼此三维布置以形成抗原结合表面
。
[0125]
如本文使用的，“抗体”是指包含一种或多种基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽的蛋白
。
公认的免疫球蛋白基因包括
κ
、
λ
、
α
、
γ
、
δ
、
ε
和
μ
恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因
。
轻链被分类为
κ
或
λ
。
重链被分类为
γ
、
μ
、
α
、
δ
或
ε
，它们依次分别定义免疫球蛋白类别
igg、igm、iga、igd
和
ige。
典型的免疫球蛋白
(
例如抗体
)
结构单元包含四聚体
。
每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻”链
(
约
25kd)
和一条“重”链
(
约
50-70kd)
，如图
1a
所示
。
每条链的
n-末端定义主要负责抗原识别的约
100-110
或更多个氨基酸的可变区
。
术语可变轻链
(vl)
和可变重链
(vh)
分别是指这些轻链和重链
。
[0126]
抗体作为完整免疫球蛋白或作为通过以各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在
。
因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下消化抗体以产生
fab
二聚体
f(ab’)2
，其本身为通过二硫键与
vh-ch1
连接的轻链
。
可在温和条件下减少
f(ab’)2
以打破铰链区中的二硫键，从而将
f(ab’)2
二聚体转变成
fab'
单体
。fab’单体本质上为具有部分铰链区的
fab(
对于其他抗体片段的更详细描述参见
fundamental immunology,w.e.paul,ed.,raven press,newyork(1999))。
尽管根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是技术人员将意识到，此类
fab’片段等可化学地或通过利用重组
dna
方法从头合成
。
因此，如本文使用的，术语抗体还包括通过修饰整个抗体产生的或者使用重组
dna
方法从头合成的抗体片段
。
[0127]
天然存在的“抗体”为包含至少通过二硫键互连的两条重
(h)
链和两条轻
(l)
链的蛋白
。
每条重链由重链可变区
(
在本文中被缩写为
vh)
和重链恒定区组成
。
重链恒定区由三个结构域
ch1、ch2
和
ch3
组成
。
每条轻链由轻链可变区
(
在本文中被缩写为
vl)
和轻链恒定区组成
。
轻链恒定区由一个结构域
cl
组成
。vh
和
vl
区可进一步被细分成高变区，其被称为互补决定区
(cdr)
，中间散布有被称为框架区
(fr)
的更保守的区域
。
每个
vh
和
vl
由三个
cdr
和四个
fr
组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：
fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞
(
例如效应细胞
)
和经典补体系统的第一组分
(c1q)。
[0128]
抗体包括单链抗体，后者包括单链
fv(sfv
或
scfv)
抗体，其中可变重链和可变轻链
(
直接地或通过肽接头
)
连接在一起以形成连续多肽
。
[0129]
抗体包括单域抗体，后者包含由能够选择性地与抗原结构域结合的单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段
。
实例包括但不限于重链抗体
、
天然缺少轻链的抗体
、
源于常规4链抗体的单域抗体
、
设计改造的抗体和不同于源于抗体的那些的单域骨架
。
单域抗体可为本领域的任何一种或任何未来的单域抗体
。
单域抗体可源于任何物种，包括但不限于小鼠
、
人类
、
骆驼
、
美洲驼
、
山羊
、
兔
、
牛
。
根据本发明的一个方面，如本文使用的，单域抗体为被称为缺少轻链的重链抗体的天然存在的单域抗体
。
此类单域抗体例如公开于
wo 9404678
中
。
为清楚起见，这种源于天然缺少轻链的重链抗体的可变结构域在本文中被称为
vhh
以使其区别于4链免疫球蛋白的常规
vh。
此类
vhh
分子可源于骆驼科物种例如骆驼
、
美洲驼
、
单峰驼
、
羊驼和原驼中产生的抗体
。
[0130]
融合蛋白的抗体结构域任选地包含免疫球蛋白分子的全部或部分，并且任选地含有免疫球蛋白可变区
(
即疾病相关抗原的特异性区域
)
的全部或部分，并且任选地包含由v基因和
/
或d基因和
/
或j基因编码的一个或多个区域
。
[0131]
如上所述
(
参见以上定义
)
，取决于实施方案的具体要求，本文使用的抗体任选地
包含
f(ab)2、f(ab’)2、fab、fab’、scfv、
单域抗体等
。
一些实施方案利用包含
igg
结构域的融合蛋白
。
然而，其他实施方案包含替代性免疫球蛋白，比如
igm、iga、igd
和
ige。
此外，各种免疫球蛋白的所有可能同种型也被包含在当前的实施方案内
。
因此，
igg1、igg2、igg3
等全部为本发明中使用的抗体融合蛋白抗体结构域中的可能分子
。
除了选择免疫球蛋白和同种型类型的选择之外，本发明的不同实施方案包含各种铰链区
(
或其功能等同物
)。
此类铰链区在抗体融合蛋白的不同结构域之间提供柔性
。
参见例如
penichet
等人，
2001“antibody-cytokine fusionproteins for the therapy ofcancer”jimmunol methods 248:91-101。
[0132]
在一些实施方案中，
ctla-4
抗原结合结构域包含轻链可变区和重链可变区
。
在一些实施方案中，重链可变区包含
gftfssyt(seq id no:5)、isydgnnk(seq id no:6)
和
artgwlgpfdy(seq id no:7)
的互补决定区
(cdr)
序列
。
在一些实施方案中，轻链可变区包含
qsvgssy(seq id no:3)、gaf
和
qqygsspwt(seq id no:4)
的
cdr
序列
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗原结合结构域包含轻链和重链
。
在一些实施方案中，重链包含
seq id no:5、seq id no:6
和
seq id no:7
的
cdr
序列
。
在一些实施方案中，轻链包含
seq id no:3、gaf
和
seq id no:4
的
cdr
序列
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗原结合结构域包含含有
seq id nos:5、6
和7的
cdr
序列的重链以及含有
seq id no:3、gaf
和
seq id no:4
的
cdr
序列的轻链
。
[0133]
示例性但非限制性的
ctla-4cdr
序列显示于以下表
1。
[0134]
表
1.
对
ctla-4
有特异性的抗体的
cdr
序列
[0135][0136]
在一些实施方案中，
ctla-4
抗原结合结构域包含抗体
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含重链和轻链
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含第一重链
、
第二重链和两个轻链
(
参见例如图
1a)
，并且两条链的序列不相同
。
示例性的
ctla-4
抗体序列，包括重链
、
轻链
、
恒定和可变区，显示于以下图
2。
[0137]
表
2.
对
ctla-4
有特异性的抗体的序列
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144][0145][0146]
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含含有
seq id no:9
的序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列的轻链序列
。
在一些实施方
案中，
ctla-4
抗体包含含有
seq id no:9
或基本上由其组成的轻链序列
。
[0147]
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含含有
seq id no:12
的重链可变区序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列的一个或多个重链序列
。
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含含有
seq id no:12
的重链可变区序列或者与其具有至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列的一个或多个重链序列
。
在一些实施方案中，重链可变区序列包含
seq id no:12
或基本上由其组成
。
在一些实施方案中，重链可变区由包含
seq id no:28
的序列的多核苷酸编码
。
[0148]
在一些实施方案中，
ctla-4
抗体包含第一重链和第二重链，并且两条重链的序列不相同
。
在一些实施方案中，第一和第二重链两者均包含
seq id no:12
的重链可变区序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第一和第二重链两者均包含含有
seq id no:12
或基本上由其组成的重链可变区序列
。
[0149]
本文所述抗体的重链恒定区可被设计改造为优先形成两条不同重链的异二聚体
。
此类设计改造的非限制性实例为“杵臼”技术，该技术在例如
wo 96/027011、ridgway,j.b.
等人，
protein eng.9(1996)617-621
和
merchant,a.m.
等人，
nat.biotechnol.16(1998)677-681
中以几个实例进行了详细描述
。
在该方法中，改变两个
ch3
结构域的相互作用表面以增加含有这两个
ch3
结构域的两条重链的异二聚化
。(
两条重链的
)
两个
ch3
结构域之一可为“杵”，而另一个为“臼”。
例如，伊匹单抗重链
(seq id no:8)
可用
t367s、l369a
和
y408v
突变进行设计改造以产生“臼”重链，和用
t367w
突变进行设计改造以产生“杵”重链
。
携带这些取代的杵和臼重链将优先地
(
即以更高频率
)
形成杵
/
臼异二聚体，而不是杵
/
杵或臼
/
臼同二聚体
。
[0150]
在一些实施方案中，第一和第二重链在恒定区中相差至少一个氨基酸
。
例如，第一和第二重链可在重链恒定区中具有
1、2、3、4
或5个氨基酸的差异
。
在一些实施方案中，第一和第二重链在恒定区中相差3个氨基酸
。
例如，第一和第二重链可在
seq id no:13
或
seq id no:14
的位置
249、251、290
或其任何组合处不同
。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:13
或
seq id no:14
的
249
位的
s、251
位的a和
290
位的v，而第二重链包含
seq id no:13
或
14
的
249
位的
w、251
位的
l
和
290
位的
y。
[0151]
在一些实施方案中，第一和第二重链可在
seq id no:10
或
11
的位置
350、355、367、369、408
或其任何组合处不同
。
[0152]
在一些实施方案中，第一重链包含相对于
seq id no:10
或
11
在
367
位的
s、369
位的a和
408
位的
t
，和第二重链包含相对于
seq id no:10
或
11
在
367
位的
w。
在一些实施方案中，第一重链包含相对于
seq id no:10
或
11
在
367
位的
s、369
位的a和
408
位的v，和第二重链包含相对于
seq id no:10
或
11
在
367
位的
w。
任选地，第一重链包含相对于
seq id no:10
或
11
在
350
位的c，和第二重链包含相对于
seq id no:10
或
11
在
355
位的
c。
[0153]
在一些实施方案中，第一重链包含相对于
seq id nos:10
或
11
在
408
位的
t
，和第二重链包含相对于
seq id nos:10
或
11
在
367
位的
w。
[0154]
在任何上述实施方案中，第一和
/
或第二重链可包含相对于
seq id nos:10
或
11
在
235
位的
f、250
位的a和
435
位的
a。
[0155]
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:13
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列，以及在
seq id no:13
的
251
位的a和
290
位的
v。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:13
的序列
。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:14
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列，以及在
seq id no:14
的
249
位的
w、251
位的
l
和
300
位的
y。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:14
的序列
。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:13
的序列，和第二重链包含
seq id no:14
的序列
。
[0156]
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:11
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:11
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列，以及在
seq id no:11
的
367
位的
s、369
位的a和
408
位的
v。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:11
的序列或基本上由其组成
。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:10
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:10
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列，以及在
seq id no:10
的
367
位的
w。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:10
或基本上由其组成
。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:11
或基本上由其组成，和第二重链包含
seq id no:10
或基本上由其组成
。
[0157]
接头
[0158]
在本公开融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个接头
。
例如，在具有与抗
ctla-4
抗体的重链融合的
il-15
结构域和
il-15ra sushi
结构域的融合蛋白中，重链
、il-15
结构区和
il-15ra
结构域中的一个或多个可被接头分开
。
[0159]
术语“接头”为领域公认的并且是指连接两种化合物
(
比如两种多肽
)
的分子
(
包括但不限于未修饰或修饰的核酸或氨基酸
)
或分子组
(
例如2个或更多个，例如
2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100
或更多个
)。
接头可由单个连接分子组成，或者可包含连接分子和至少一个预期将连接分子和化合物分开特定距离的间隔物
。
[0160]
在一些实施方案中，接头包含甘氨酸-丝氨酸
(gs)
接头
。
示例性的
gs
接头包括但不限于
gggs(seq id no:23)、ggggs(seq id no:24)、ggggsggggs(seq id no:25)、ggggsggggsggggs(seq id no:26)
和
ggggsggggsggggsggggs(seq id no:15)。
[0161]
在一些实施方案中，
ctla-4
抗原结合结构域和
il-15ra
结构域被接头分开
。
在一些实施方案中，例如其中
ctla-4
抗原结合结构域为抗体的那些实施方案中，抗体的第一或第二重链和
il-15ra
结构域被接头分开
。
在一些实施方案中，接头包含
gggs(seq id no:23)、ggggs(seq id no:24)、ggggsggggs(seq id no:25)、ggggsggggsggggs(seq id no:26)
或
ggggsggggsggggsggggs(seq id no:15)。
在一些实施方案中，接头包含
gggggsggggsggggs(seq id no:26)。
在一些实施方案中，编码接头的序列包含
ggcggaggcggaggatctggtggtggtggatctggcggcggaggctct(seq id no:27)
的序列
。
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域被接头分开
。
在一些实施方案中，接头包含
gggs(seq id no:23)、ggggs(seq id no:24)、ggggsggggs(seq id no:25)、ggggsggggsggggs(seq id no:26)
或
ggggsggggsggggsggggs(seq id no:15)。
在一些实施方案中，接头包含
ggggsggggsggggsggggs(seq id no:15)。
在一些实施方案中，编码接头的序列包含
ggtggcggaggtagcggtggtggcggtagcggaggcggtggttctggcggaggcggttct(seq id no:32)
的序列
。
[0162]
在本文所述的重组融合蛋白的一些实施方案中，对
ctla-4
有特异性的抗原结合结构域包含抗体
。
在一些实施方案中，如图
1a
中所见，抗体包含两条重链和两条轻链
。
在一些实施方案中，两条重链
(
第一和第二重链，如本文所提及
)
的序列不相同
。
例如，第一重链包含对恒定区的一个或多个修饰以产生“臼”变体，和第二重链包含对恒定区的一个或多个修饰以产生“杵”变体，反之亦然
。
在一些实施方案中，臼和杵变体优先缔合以形成异二聚体
。
在一些实施方案中，第一重链包含
seq id no:13
的恒定区序列，和第二重链包含
seq id no:14
的恒定区序列
。
在备选实施方案中，第一重链包含
seq id no:14
的序列，和第二重链包含
seq id no:13
的序列
。
[0163]
多肽
[0164]
本公开提供包含以下的重组融合蛋白：
(a)
从
n-到
c-末端含有第一
ctla-4
抗体重链
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域序列的第一多肽；
(b)
含有第二
ctla-4
重链序列的第二多肽；和
(c)
含有
ctla-4
抗体轻链序列的两条另外多肽
。
[0165]
在一些实施方案中，第一多肽从
n-到
c-末端包含抗
ctla-4
抗体的重链
、
第一接头
、il-15ra sushi
结构域
、
第二接头和
il-15
结构域的序列
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白包含含有抗
ctla-4
抗体第二重链的序列的第二多肽，所述第二重链的序列与第一重链不相同
(
例如第一重链包含臼变体，和第二重链包含杵变体，反之亦然
)。
在一些实施方案中，第一和第二多肽优先形成异二聚体
。
在一些实施方案中，重链和
il-15ra sushi
结构域被第一接头分开
。
在一些实施方案中，
il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域被第二接头分开
。
在一些实施方案中，第一和
/
或第二接头为甘氨酸-丝氨酸接头
。
[0166]
在一些实施方案中，第一多肽从
n-到
c-末端包含
seq id no:11
的抗
ctla-4
重链
、seq id no:26
的第一接头
、seq id no:2
的
il-15ra sushi
结构域
、seq id no:15
的第二接头和
seq id no:1
的
il-15
结构域的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第一多肽从
n-到
c-末端包含
seq id no:11
的抗
ctla-4
重链
、seq id no:26
的第一接头
、seq id no:2
的
il-15ra sushi
结构域
、seq id no:15
的第二接头和
seq id no:1
的
il-15
结构域的序列
。
在一些实施方案中，第一多肽包含
seq id no:16
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第一多肽包含
seq id no:16
的序列或基本上由其组成
。
在一些实施方案中，第一多肽由包含
seq id no:18
的序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列的多核苷酸编码
。
在一些实施方案中，第一多肽由包含
seq id no:18
的序列的多核苷酸编码
。
[0167]
在一些实施方案中，包含抗
ctla-4
抗体的第二重链的第二多肽不包含第二重链与任何另外的异源结构域比如
il-15ra sushi
结构域或
il-15
结构域的融合
。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:10
的序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列，或者基本上由上述序列组成
。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:10
的序列或基本上由其组成
。
在一些实施方案中，第二多肽由包含
seq id no:19
的序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列的多核苷酸编码
。
在一些实施方案中，第二多肽由包含
seq id no:19
的序列的多核苷
酸编码
。
[0168]
在一些实施方案中，重组融合蛋白进一步包含含有抗
ctla-4
抗体轻链序列的两个另外的多肽
。
在一些实施方案中，包含抗
ctla-4
轻链的两个另外的多肽包含
seq id no:9
的序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列，或者基本上由上述序列组成
。
在一些实施方案中，包含抗
ctla-4
轻链的两个另外的多肽包含
seq id no:9
的序列或基本上由其组成
。
在一些实施方案中，两个另外的多肽的抗
ctla-4
抗体轻链序列由包含
seq id no:17
的序列或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列的多核苷酸编码
。
在一些实施方案中，两个另外的多肽的抗
ctla-4
抗体轻链序列由包含
seq id no:17
的序列的多核苷酸编码
。
[0169]
在一些实施方案中，重组融合蛋白包含含有
seq id no:16
的序列的第一多肽
、
含有
seq id no:10
的序列的第二多肽和含有
seq id no:9
的序列的两个另外多肽
。
[0170]
多核苷酸和载体
[0171]
本公开提供编码本文所述重组融合蛋白的多核苷酸
。
[0172]
本公开提供包含编码第一多肽的序列的第一多核苷酸，所述第一多肽从
n-到
c-末端包含
seq id no:11
的抗
ctla
重链的第一重链
、seq id no:26
的第一接头
、seq id no:2
的
il-15ra sushi
结构域
、seq id no:15
的第二接头和
seq id no:1
的
il-15
结构域
。
在一些实施方案中，第一多核苷酸包含
seq id no:16
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第一多核苷酸包含
seq id no:16
的序列
。
[0173]
本公开提供包含编码第二多肽的序列的第二多核苷酸，所述第二多肽包含
seq id no:10
的抗
ctla-4
抗体的第二重链
。
在一些实施方案中，第二重链不与另外的异源结构域比如
il-15ra sushi
结构域或
il-15
结构域融合
。
在一些实施方案中，第二重链包含
seq id no:10
的序列或基本上由其组成，并且第二多核苷酸包含
seq id no:19
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第二多核苷酸包含
seq id no:19
的序列
。
[0174]
本公开提供包含编码第三多核苷酸的序列的第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码抗
ctla-4
抗体的轻链
。
在一些实施方案中，抗
ctla-4
抗体轻链包含
seq id no:9
的序列或基本上由其组成，并且第三多核苷酸包含
seq id no:17
的序列，或者与其具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％或至少
99
％同一性的序列
。
在一些实施方案中，第三多核苷酸包含
seq id no:17
的序列
。
[0175]
在一些实施方案中，编码第一
、
第二和第三多肽中每一个的多核苷酸序列可操作地连接于一个或多个启动子
。
例如，两个或更多个多肽的序列可以可操作地连接相同启动子
(
在其控制下
)
，并被一种或多种产生分别的多肽比如自裂解多肽
、
内部核糖体进入位点等的元件分开
。
[0176]
在备选实施方案中，编码包含第一重链
、
第二重链和轻链的第一
、
第二和第三多肽的序列第一
、
第二和第三多核苷酸在三个分别的启动子的控制下
。
例如，可将第一
、
第二和第三多核苷酸中的每一个克隆到分别的表达载体中，每个载体包含其自身的启动子和
/
或调控序列
。
在一些实施方案中，可操作地连接于第一
、
第二和第三多核苷酸中每一个的启动子为相同的
。
在一些实施方案中，可操作地连接于第一
、
第二和第三多核苷酸中每一个的启
动子为不相同的
。
[0177]
在一些实施方案中，编码包含第一重链
、
第二重链和轻链的第一
、
第二和第三多肽的第一
、
第二和第三多核苷酸中的一个或多个为单个连续多核苷酸分子的一部分
。
[0178]
在备选实施方案中，包含第一重链
、
第二重链和轻链的第一
、
第二和第三多肽各自由不同的非连续多核苷酸分子上的多核苷酸序列编码
。
[0179]
在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的程序和方法，使用
pcr
技术制备本发明的多核苷酸
。
在一些实施方案中，所述程序涉及两个不同
dna
序列的连接
(
参见例如“current protocols in molecular biology”,eds.ausubel
等人，
john wiley&sons,1992)。
[0180]
当多核苷酸序列被置于与另一个多核苷酸序列的功能性关系时，所述多核苷酸序列为“可操作地连接的”。
例如，如果多核苷酸前序列或分泌前导不备表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接于编码多肽的核酸；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可操作地连接于编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，则其可操作地连接于编码序列
。
通常，“可操作地连接的”意指所连接的多核苷酸序列为连续的，并且在分泌前导的情况下为连续且处于阅读框中的
。
然而，增强子任选地为连续的
。
连接可例如通过在方便的限制性位点处连接来完成
。
如果不存在此类位点，则可使用合成的寡核苷酸衔接子
(adaptor)、
接头或本领域已知的其他方法
。
在另一个实施方案中，“可操作地连接”还指不同的氨基酸序列
、
肽或蛋白的功能性配对，如本文所述的抗
ctla-4
抗体和
il-15ra sushi
结构域和
il-15
经由也在本文中描述的接头序列的组合
。
[0181]
本公开提供包含含有本文所述重组融合蛋白的多核苷酸的载体
。
[0182]
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指借以可将
dna
或
rna
序列
(
例如外来基因
)
引入到宿主细胞内，以便转化宿主并促进所引入序列的表达
(
例如转录和翻译
)
的媒介物
。
载体包括质粒
、
噬菌体
、
病毒等
。
[0183]
术语“表达
(express)”和“表达
(expression)”意指允许或引起基因或
dna
序列中的信息变得显现出来，例如通过激活参与相应基因或
dna
序列的转录和翻译的细胞功能来产生蛋白
。dna
序列在细胞中或由细胞表达，以形成“表达产物”，比如蛋白
。
表达产物本身，例如产生的蛋白，也可以说是由细胞“表达”的
。
表达产物可被表征为细胞内
、
细胞外或跨膜的
。
术语“细胞内”意指细胞内的某物
。
术语“细胞外”意指细胞外的某物
。
术语“跨膜的”意指具有细胞外的细胞外结构域
、
嵌入细胞膜的部分和细胞内的细胞内结构域的某物
。
[0184]
在一些实施方案中，将本发明的多核苷酸插入到表达载体
(
即核酸构建体
)
中，以使得可表达本文所述的重组融合蛋白和多肽
。
[0185]
在一些实施方案中，本发明的表达载体包括使得该载体适合于在原核生物中复制和整合的另外的序列
。
在一些实施方案中，本发明的表达载体包括使得该载体适合于在真核生物中复制和整合的另外的序列
。
在一些实施方案中，本发明的表达载体包括使得该载体适合于在原核生物和真核生物两者中复制和整合的穿梭载体
。
例如，此类载体可包括适合于真核和原核细胞两者的选择性标记
。
合适的标记物为本领域普通技术人员显而易见的
。
[0186]
在一些实施方案中，克隆载体包含转录和翻译起始序列
(
例如启动子
、
增强子
)
以及转录和翻译终止子
(
例如多腺苷酸化信号
)
以增强从其表达的多肽的表达
。
合适的翻译终
止子包括但不限于牛生长激素多腺苷酸化信号
(bgh
多聚
a)
等
。
合适的启动子对本领域普通技术人员将为显而易见的，并且包括
cmv
启动子
、
肌动蛋白启动子等
。
[0187]
在一些实施方案中，本发明的表达载体可进一步包括另外的多核苷酸序列，后者允许例如从单个
mrna
比如内部核糖体进入位点
(ires)
和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列翻译若干个蛋白
。
[0188]
在一些实施方案中，本发明的表达载体包括增加本发明重组融合蛋白表达的元件
。
此类特征包含但不限于选择启动子和多腺苷酸化
。
在一些实施方案中，多腺苷酸化序列为牛生长激素
(bgh)
多腺苷酸化序列
。
在一些实施方案中，启动子包括组成型活性启动子
。
在一些实施方案中，启动子包括巨细胞病毒启动子
(pcmv)。
在一些实施方案中，启动子可与另外的元件组合以促进本公开重组蛋白的表达，比如内含子
(
例如兔
β
珠蛋白内含子
、ef1a
内含子等
)
和增强子元件
(cmv
立即早期增强子
、sv40
增强子
、ef1a
增强子
、
腺病毒主要晚期蛋白增强子等
)。
[0189]
示例性的哺乳动物表达载体包括但不限于可从
invitrogen
获得的
pcdna3、pcdna3.1(+/-)、pgl3、pzeosv2(+/-)、psectag2、pdisplay、pef/myc/cyto、pcmv/myc/cyto、pcr3.1、psinrep5、dh26s、dhbb、pnmt1、pnmt41、pnmt81
，可从
promega
获得的
pci
，可从
strategene
获得的
pmbac、ppbac、pbk-rsv
和
pbk-cmv
，可从
clontech
获得的
ptres
及其衍生物
。
[0190]
在一些实施方案中，本发明使用含有来自真核病毒比如逆转录病毒的调控元件的表达载体
。sv40
载体包括
psvt7
和
pmt2。
在一些实施方案中，源于牛乳头瘤病毒的载体包括
pbv-1mtha
，和源于爱泼斯坦巴尔病毒的载体包括
phebo
和
p205。
其他示例性的载体包括
pmsg、pav009/a+、pmto10/a+、pmamneo-5、
杆状病毒
pdsve
和允许在
sv-40
早期启动子
、sv-40
晚期启动子
、
金属硫蛋白启动子
、
鼠乳房肿瘤病毒启动子
、
劳斯肉瘤病毒启动子
、
多角体蛋白启动子或显示对于在真核细胞中表达有效的其他启动子的引导下表达蛋白的任何其他载体
。
[0191]
在一些实施方案中，例如在被用于表达本发明重组融合蛋白的细菌系统中，可取决于预期用于所表达蛋白的用途来有利地选择许多表达载体
。
在一些实施方案中，引导可能作为与疏水信号序列的融合的蛋白产物的高水平表达的载体是所期望的，所述载体将表达的产物引导到其中易于纯化蛋白产物的细菌周质或培养基中
。
在一个实施方案中，某个融合蛋白设计改造为具有特定切割位点以助于多肽的回收
。
在一个实施方案中，可适于这种操纵的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体
pet
系列
[studier
等人，
methods in enzymol.185:60-89(1990)]。
[0192]
在一些实施方案中，使用酵母表达系统来表达本公开重组融合蛋白
。
在一个实施方案中，如美国专利号
5,932,447
中公开的，可在酵母中使用多种含有组成型或诱导型启动子的载体
。
在另一个实施方案中，使用促进外来
dna
序列整合到酵母染色体中的载体
。
[0193]
在一些实施方案中，重组病毒载体可用于本发明的多肽的体内表达，因为它们提供诸如侧向感染
(lateral infection)
和靶向特异性等优点
。
在一个实施方案中，侧向感染为例如逆转录病毒的生命周期中固有的，并且为单个感染细胞借以产生许多出芽并感染邻近细胞的子代病毒体的过程
。
在一个实施方案中，结果为大面积变为快速受到感染，其中大部分区域最初未被初始病毒颗粒感染
。
在一个实施方案中，产生不能侧向扩散的病毒载体
。
在一个实施方案中，如果期望的目的为仅将指定基因引入到局部数量的靶向细胞中，则该特性可为有用的
。
[0194]
在一些实施方案中，哺乳动物细胞表达系统被用于表达本公开的重组融合蛋白
。
哺乳动物细胞可为例如中国仓鼠卵巢
(cho)
细胞或其衍生物，并且载体为适合于在
cho
细胞中表达重组融合蛋白的载体
。
[0195]
将会意识到的是，除含有用于插入的编码序列
(
其编码多肽
)
的转录和翻译的必需元件以外，本发明的表达构建体还可包括被设计改造以优化所表达多肽的稳定性
、
产生
、
纯化
、
产率或活性的序列
。
[0196]
制造方法
[0197]
本公开提供制备包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白的方法，其包括：
(a)
使多个细胞与编码重组融合蛋白的多核苷酸或载体接触；
(b)
由该多个细胞表达该重组融合蛋白；和
(c)
纯化该重组融合蛋白
。
[0198]
多种原核或真核细胞可被用作表达本发明重组融合蛋白的宿主表达系统
。
在一些实施方案中，这些包括但不限于微生物，比如用含有多肽编码序列的重组细菌噬菌体
dna、
质粒
dna
或粘粒
dna
表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母
。
[0199]
在一些实施方案中，多个细胞包含真核细胞
。
在一些实施方案中，真核细胞为哺乳动物细胞
。
适用于表达重组融合蛋白的哺乳动物细胞包括
cho
细胞
、per.c6
细胞
、
鼠
ns0
细胞和
hek293
细胞
。
选择合适的细胞系对于本领域普通技术人员将为显而易见的
。
[0200]
在一些实施方案中，多个细胞包含原核细胞，例如大肠杆菌细胞
。
[0201]
在一些实施方案中，使多个细胞与编码重组融合蛋白的多核苷酸或载体接触包括转染
。
[0202]
术语“转染”意指使用重组
dna
技术将外来核酸引入到细胞中
。
术语“转化”意指将“外来”(
即外在或细胞外
)
基因
、dna
或
rna
序列引入到宿主细胞，使得宿主细胞将会表达引入的基因或序列以产生期望的物质，一般为由引入的基因或序列编码的蛋白或酶
。
引入的基因或序列也可被称为“克隆的”或“外来的”基因或序列，可包括调控或控制序列，比如起始
、
终止
、
启动子
、
信号
、
分泌或由细胞遗传机器
(genetic machinery)
使用的其他序列
。
基因或序列可包括非功能序列或不具有已知功能的序列
。
接收并表达引入的
dna
或
rna
的宿主细胞已被“转化”并且为“转化体”或“克隆”。
引入到宿主细胞的
dna
或
rna
可来自任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或者不同属或种的细胞
。
[0203]
在一些实施方案中，使多个细胞与编码重组融合蛋白的多核苷酸或载体接触包括转导
。
术语“转导”意指使用病毒载体比如慢病毒载体将外来核酸引入到细胞中
。
[0204]
在一些实施方案中，使用非细菌表达系统
(
例如哺乳动物表达系统，比如
cho
细胞
)
来表达本发明的多肽
。
在一些实施方案中，被用于在哺乳动物细胞中表达本发明多核苷酸的表达载体包含
cmv
启动子和新霉素抗性基因
。
在备选实施方案中，被用于在哺乳动物细胞中表达本发明多核苷酸的表达载体包含在
sv40
启动子控制下的谷氨酰胺合成酶标记物
(gs)。
[0205]
在一些实施方案中，可使用各种方法将编码本发明重组融合蛋白的表达载体引入到细胞中
。
这种方法通常在
sambrook
等人，
molecular cloning:a laboratory manual,
cold springs harbor laboratory,new york(1989,1992)
中，在
ausubel
等人，
current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md.(1989)
，
chang
等人，
somatic gene therapy,crc press,ann arbor,mich.(1995)
，
vega
等人，
gene targeting,crc press,ann arbormich.(1995)
，
vectors:a survey ofmolecular cloning vectors and their uses,butterworths,boston mass.(1988)
以及
gilboa
等人
[biotechniques 4(6):504-512,1986]
中描述，并且包括例如用重组病毒载体的稳定或瞬时转染
、
脂质转染
、
电穿孔和感染
。
另外，对于阳性-阴性选择方法，参见美国专利号
5,464,764
和
5,487,992。
[0206]
在一些实施方案中，因为由于病毒的感染性可获得更高的转染效率，所以通过病毒感染引入核酸提供超过其他方法比如脂质转染和电穿孔的几个优点
。
[0207]
在一些实施方案中，在允许表达大量重组融合蛋白或多肽的有效条件下培养转化的细胞
。
在一些实施方案中，有效的培养条件包括但不限于允许蛋白产生的有效的培养基
、
生物反应器
、
温度
、ph
和氧气条件
。
在一个实施方案中，有效的培养基是指其中培养细胞以产生本发明重组多肽的任何培养基
。
在一些实施方案中，培养基一般地包括具有可同化的碳
、
氮和磷酸盐源以及适当的盐
、
矿物质
、
金属和其他营养物比如维生素的水溶液
。
在一些实施方案中，可在常规发酵生物反应器
、
摇瓶
、
试管
、
微量滴定皿和皮氏培养皿中培养本发明的细胞
。
在一些实施方案中，在适合于重组细胞的温度
、ph
和氧含量下实施培养
。
在一些实施方案中，培养条件处于本领域普通技术人员的专业知识范围内
。
[0208]
例如，用于培养真核细胞的适当培养基包括但不限于
iscove
改良杜氏培养基
、rpmi 1640、
最低必需培养基
α
(mem
α
)、
杜氏改良的伊格尔培养基
(dmem)、grace
完全昆虫培养基
、
含
l-谷氨酰胺的
hamf-10
或
f-12、
施耐德氏昆虫培养基或本领域技术人员已知的任何其他培养基
。
另外，如本文所述的培养基包括但不限于化学上明确的培养基
、
含有水解产物的培养基和简单培养基
。
针对特定细胞类型选择适当的培养基和细胞培养条件对本领域普通技术人员将为显而易见的
。
[0209]
在一些实施方案中，取决于被用于产生的载体和宿主系统，生成的本发明多肽保留于重组细胞内，分泌到发酵培养基中，分泌到两个细胞膜之间的空间比如大肠杆菌中的周质空间中，或保留于细胞或病毒膜的外表面上
。
[0210]
在一些实施方案中，在于培养中预定时间后，回收重组融合蛋白或多肽
。
[0211]
在一个实施方案中，本文使用的短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的整个发酵培养基，并且不需意指分离或纯化的另外步骤
。
[0212]
在一些实施方案中，使用多种标准蛋白纯化技术纯化本发明的多肽，所述技术比如但不限于亲和色谱
、
离子交换色谱
、
过滤
、
电泳
、
疏水相互作用色谱
、
凝胶过滤色谱
、
反相色谱
、
伴刀豆球蛋白a色谱
、
色谱聚焦和差异增溶
(differential solubilization)。
[0213]
在一些实施方案中，为便于回收，可将表达的编码序列设计改造为编码本发明的多肽和融合的可切割部分
。
在一个实施方案中，可设计融合蛋白以使得可通过亲和色谱，例如通过固定在对可切割部分有特异性的柱上而容易地分离多肽
。
在一个实施方案中，在多肽与可切割部分之间设计改造可切割位点，并且可通过在该位点处用特异性地切割融合蛋白的适当的酶或物质处理而将多肽从色谱柱中释放出来
[
例如参见
booth
等人，
immunol.lett.19:65-70(1988)
；和
gardella
等人，
j.biol.chem.265:15854-15859
(1990)]。
[0214]
在一些实施方案中，以“基本上纯的”形式回收本发明的多肽
。
短语“基本上纯的”是指允许在本文所述的应用中有效使用蛋白的纯度
。
[0215]
在一些实施方案中，还可使用体外表达系统合成本发明的多肽
。
在一个实施方案中，体外合成方法为本领域众所周知的，并且系统的组分为市售可获得的
。
[0216]
在一些实施方案中，合成和纯化多肽；并且在体内或体外测定其治疗功效
。
[0217]
药用组合物
[0218]
本公开提供药用组合物，其包含含有
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白和药学上可接受的载剂
、
稀释剂或赋形剂
。
[0219]
如本文使用的，“药用载剂”包括生理学上相容性的任何和所有溶剂
、
分散介质
、
包衣
、
抗细菌和抗真菌剂
、
等渗和吸收延迟剂等
。
载剂材料为非毒性的，并且不干扰活性成分生物活性的有效性
。
此类制剂可通常含有盐
、
缓冲剂
、
防腐剂
、
相容性载剂和任选地其他治疗剂
。
此类药学上可接受的制剂也可通常含有适合于给予到人类体内的相容性固体或液体填充剂
、
稀释剂或包封物质
。
术语“载剂”表示天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其组合以促进应用
。
优选地，载剂适合于静脉内
、
肌内
、
皮下
、
胃肠外
、
脊柱或表皮给予
(
例如通过注射或输注
)。
[0220]
药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液
。
药用载剂包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂
。
此类介质和药剂用于药用活性物质的用途为本领域已知的
。
[0221]
药用组合物可以本领域已知并且可接受用于治疗用途的形式存在
。
在一些实施方案中，本发明的药用组合物为液体制剂
。
在其他实施方案中，本发明的药用组合物为冻干的
。
在进一步的实施方案中，本发明的药用组合物为重构的液体制剂
。
在一些实施方案中，本发明的液体制剂为水性制剂
。
在其他实施方案中，液体制剂为非水性的
。
[0222]
包含本公开重组融合蛋白的组合物可通过本领域已知的多种方法进行配制用于给予
。
如本领域普通技术人员将意识到的，给予的途径和
/
或模式将根据期望的结果而变化
。
为通过某些给予途径给予本公开的组合物，可能需要将组合物与材料共同给予以防止其失活
。
例如，重组融合蛋白可在适当的载剂例如脂质体或稀释剂中给予受试者
。
[0223]
在一些实施方案中，用于给予受试者的制剂包括无菌水性或非水性溶液剂
、
悬浮剂和乳剂
。
一些实施方案包括非水性溶剂，比如丙二醇
、
聚乙二醇
、
植物油
(
例如橄榄油
)、
有机酯
(
例如油酸乙酯
)
和本领域技术人员已知的其他溶剂
。
在本发明的某些实施方案中任选地使用生理学上可接受的载剂
(
或赋形剂
)。
此类的实例包括例如盐水
、pbs、
林格氏溶液
、
乳酸林格氏溶液等
。
另外，将防腐剂和添加剂任选地添加到组合物中以助于确保稳定性和无菌性
。
例如，抗生素和其他杀菌剂
、
抗氧化剂
、
螯合剂等均任选地存在于本文组合物的各个实施方案中
。
[0224]
无论选择哪种给予途径，以合适的水合形式使用的本公开组合物和
/
或本发明的药用组合物均可通过本领域普通技术人员已知的常规方法被配制成药学上可接受的剂型
。
[0225]
重组融合蛋白或包含它的药用组合物在任何适当的无菌药用载剂中任选地给予
(
治疗上或预防上
)
需要治疗的受试者
。
此类药用载剂作用于保持融合蛋白的溶解性和作用
。
[0226]
在一些实施方案中，用于本文公开方法的组合物包括溶液剂或乳剂，其在一些实施方案中为包含安全和有效量的本文公开的化合物以及任选地预期用于各种给予途径的其他化合物的水性溶液剂或乳剂
。
[0227]
组合物必须为无菌和流动的，至组合物可通过注射器递送的程度
。
除水之外，载剂优选地为等渗缓冲盐水溶液
。
可例如通过使用包衣比如卵磷脂
、
通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性
。
在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖
、
多元醇
(
比如甘露醇或山梨醇
)
以及氯化钠
。
[0228]
本发明药用组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以便获得对特定受试者
、
组合物和给予模式有效实现期望的治疗反应而不会对受试者有毒性的活性成分的量
。
选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括采用的特定的本发明组合物的活性，所采用特定化合物的给予途径
、
给予时间
、
排泄率，治疗的持续时间，与采用的特定组合物组合使用的其他药物
、
化合物和
/
或材料，所治疗受试者的年龄
、
性别
、
体重
、
状况
、
总体健康和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素
。
[0229]
治疗方法
[0230]
本公开提供在需要其的受试者治疗疾病或障碍的方法，该方法包括给予治疗有效量的重组融合蛋白或包含本文公开的重组融合蛋白的药用组合物
。
[0231]
在本文所述方法的一些实施方案中，重组融合蛋白或包含它的药用组合物抑制
ctla-4
对受试者免疫细胞的活性
。
例如，重组融合蛋白的
ctla-4
抗原结合结构域充当
ctla-4
拮抗剂
。
[0232]
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物增加免疫细胞白细胞介素
2/
白细胞介素
15
受体
β
(il-2rb)/
共有
γ
链
(il-2rg)
受体复合物的活性
。
例如，组合的
il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域结合并激活该
il-2/il-15rb/
共有
γ
链受体复合物
。
免疫细胞可为受试者的免疫细胞或例如作为过继细胞疗法的一部分而给予受试者的免疫细胞
。
[0233]
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物促进免疫细胞中的活性
。
在一些实施方案中，活性包括激活
、
增殖或其组合
。
在一些实施方案中，免疫细胞为
t
细胞
、b
细胞或
nk
细胞
。
在一些实施方案中，
t
细胞为
cd8+t
细胞
。
[0234]
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物增加
nk
细胞的增殖
。
[0235]
疾病和障碍
[0236]
本公开提供治疗受试者中疾病或障碍的方法，其包括给予受试者包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0237]
在一些实施方案中，疾病或障碍为癌症
。
在一些实施方案中，癌症包括液体或实体肿瘤
。
[0238]
在一些实施方案中，液体肿瘤包括白血病
、
急性髓系白血病
、
骨髓瘤
、
急性髓性白血病
(aml)、
急性成淋巴细胞性白血病
(all)、
淋巴瘤
、
霍奇金淋巴瘤
、
非霍奇金淋巴瘤
、
β-细胞淋巴瘤
、
慢性淋巴细胞白血病
、
或慢性髓性白血病
、
套细胞淋巴瘤
、
滤泡性淋巴瘤
、t-细胞淋巴瘤
、nk-细胞淋巴瘤
、b-细胞淋巴瘤或
nkt-细胞淋巴瘤
。
[0239]
在一些实施方案中，癌症包括实体肿瘤
。
在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤
、
肾细胞癌
、
间皮瘤
、
小细胞肺癌
、
葡萄膜黑色素瘤
、
膀胱癌
、
胃癌
、
头颈部鳞状细胞癌
、
皮肤
癌
、
非小细胞肺癌
、
结直肠癌
、
前列腺癌
、
卵巢癌
、
宫颈癌
、
子宫内膜癌
、
乳腺癌
、
胰腺癌
、
尿路上皮癌
、
食管癌
、
肝细胞癌
、
成胶质细胞瘤
、
神经胶质瘤或肉瘤
。
[0240]
在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤和肾细胞癌
。
[0241]
在一些实施方案中，癌症选自肾上腺皮质癌
、aids
相关癌症
、aids
相关淋巴瘤
、
肛门癌
、
肛门直肠癌
、
肛管癌
、
阑尾癌
、
儿童期小脑星形细胞瘤
、
儿童期脑星形细胞瘤
、
基底细胞癌
、
皮肤癌
(
非黑色素瘤
)、
胆道癌
、
肝外胆管癌
、
肝内胆管癌
、
膀胱癌
、
泌尿膀胱癌
、
骨和关节癌
、
骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤
、
脑癌
、
脑瘤
、
脑干神经胶质瘤
、
小脑星形细胞瘤
、
脑星形细胞瘤
/
恶性神经胶质瘤
、
室管膜瘤
、
髓母细胞瘤
、
幕上原始神经外胚层肿瘤
、
视觉通路和下丘脑神经胶质瘤
、
乳腺癌
、
支气管腺瘤
/
类癌
、
类癌瘤
、
胃肠道
、
神经系统癌
、
神经系统淋巴瘤
、
中枢神经系统癌症
、
中枢神经系统淋巴瘤
、
宫颈癌
、
儿童期癌症
、
慢性淋巴细胞白血病
、
慢性髓性白血病
、
慢性骨髓增殖性障碍
、
结肠癌
、
结直肠癌
、
皮肤
t
细胞淋巴瘤
、
淋巴样肿瘤
、
蕈样真菌病
、
塞泽里综合征
、
子宫内膜癌
、
食管癌
、
颅外生殖细胞瘤
、
性腺外生殖细胞瘤
、
肝外胆管癌
、
眼癌
(eye cancer)、
眼内黑色素瘤
、
视网膜母细胞瘤
、
胆囊癌
、
胃
(gastric)(
胃
(stomach))
癌
、
胃肠道类癌瘤
、
胃肠道间质瘤
(gist)、
生殖细胞瘤
、
卵巢生殖细胞瘤
、
妊娠滋养细胞肿瘤神经胶质瘤
、
头颈部癌
、
肝细胞
(
肝
)
癌
、
霍奇金淋巴瘤
、
套细胞淋巴瘤
、
滤泡性淋巴瘤
、
下咽癌
、
眼内黑色素瘤
、
眼癌
(ocular cancer)、
胰岛细胞瘤
(
内分泌胰腺
)、
卡波西肉瘤
、
肾癌
(kidney cancer)、
肾癌
(renal cancer)、
肾癌
(kidney cancer)、
喉癌
、
急性成淋巴细胞性白血病
、
急性髓系白血病
、
慢性淋巴细胞白血病
、
慢性髓性白血病
、
毛细胞白血病
、
唇和口腔癌
、
肝癌
、
肺癌
、
非小细胞肺癌
、
小细胞肺癌
、aids
相关淋巴瘤
、
非霍奇金淋巴瘤
、
原发性中枢神经系统淋巴瘤
、
瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症
、
髓母细胞瘤
、
黑色素瘤
、
眼内
(
眼
)
黑色素瘤
、
梅克尔细胞癌
、
恶性间皮瘤
、
间皮瘤
、
转移性鳞状颈癌
、
口腔癌
、
舌癌
、
多发性内分泌肿瘤综合征
、
蕈样真菌病
、
骨髓增生异常综合征
、
骨髓增生异常
/
骨髓增殖性疾病
、
慢性髓性白血病
、
急性髓系白血病
、
多发性骨髓瘤
、
慢性骨髓增殖性障碍
、
鼻咽癌
、
神经母细胞瘤
、
口癌
(oral cancer)、
口腔癌
(oral cavity cancer)、
口咽癌
、
卵巢癌
、
卵巢上皮癌
、
卵巢低度恶性潜能肿瘤
、
胰腺癌
、
胰岛细胞胰腺癌
、
副鼻窦和鼻腔癌
、
甲状旁腺癌
、
阴茎癌
、
咽癌
、
嗜铬细胞瘤
、
松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤
、
垂体瘤
、
浆细胞肿瘤
/
多发性骨髓瘤
、
胸膜肺母细胞瘤
、
前列腺癌
、
直肠癌
、
肾盂和输尿管
、
移行细胞癌
、
视网膜母细胞瘤
、
横纹肌肉瘤
、
唾液腺癌
、
尤文肉瘤家族肿瘤
、
卡波西肉瘤
、
软组织肉瘤
、
上皮样肉瘤
、
滑膜肉瘤
、
子宫癌
、
子宫肉瘤
、
皮肤癌
(
非黑色素瘤
)、
皮肤癌
(
黑色素瘤
)、
梅克尔细胞皮肤癌
、
小肠癌
、
软组织肉瘤
、
鳞状细胞癌
、
胃
(stomach)(
胃
(gastric))
癌
、
幕上原始神经外胚层肿瘤
、
睾丸癌
、
咽喉癌
、
胸腺瘤
、
胸腺瘤和胸腺癌
、
甲状腺癌
、
肾盂和输尿管和其他泌尿器官的移行细胞癌
、
妊娠滋养细胞肿瘤
、
尿道癌
、
子宫内膜子宫癌
、
子宫肉瘤
、
子宫体癌
、
阴道癌
、
外阴癌和维尔姆斯氏瘤
。
[0242]
用本公开的重组融合蛋白或包含它的药用组合物治疗的癌症可根据美国癌症联合会
(american joint committee on cancer)(ajcc)
分类分期为i期
、iia
期
、iib
期
、iiia
期
、iiib
期
、iiic
期或
iv
期
。
待治疗的癌症可根据
ajcc
分类而被指定等级为
gx
级
(
例如等级不能评价
)、1
级
、2
级
、3
级或4级
。
待治疗的癌症可根据
ajcc
病理学分类
(pn)
分期为
pnx、pn0、pn0(i-)、pn0(i+)、pn0(mol-)、pn0(mol+)、pn1、pn1(mi)、pn1a、pn1b、pn1c、pn2、pn2a、pn2b、pn3、pn3a、pn3b
或
pn3c。
可替换的或另外，癌症可根据
tnm
分期系统进行分期，该系统将大多
数类型的癌症分成4期
。1
期通常意指癌症相对较小并被包含在起始器官内
。2
期癌症通常还没有开始扩散到周围组织中，但肿瘤大于1期
。
在一些实施方案中，2期意指癌症已扩散到接近肿瘤的淋巴结中
。3
期癌症通常更大，并且已开始扩散到周围组织和淋巴结中
。4
期，或转移性癌症，一般为已从起始点扩散到身体的
(
一个或多个
)
其他器官的癌症
。
[0243]
如本文使用的，“正常细胞”为不能被分类为“细胞增殖性障碍”的一部分的细胞
。
正常细胞缺乏可导致发展不需要的病症或疾病的不受调控或异常的生长，或两者兼而有之
。
优选地，正常细胞具有正常地起作用的细胞周期检查点控制机制
。
[0244]
如本文使用的，“接触细胞”是指其中重组融合蛋白或其他物质组合物与细胞直接接触或足够接近以在细胞中诱导期望的生物效应的情况
。
[0245]
如本文使用的，“单一疗法”是指给予需要它的受试者单一活性或治疗性化合物
。
优选地，单一疗法将涉及给予治疗有效量的活性化合物
。
单一疗法可与组合疗法形成对比，所述组合疗法中给予多种活性化合物的组合，优选地组合的每一组分以治疗有效量存在
。
[0246]
如本文使用的，“治疗
(treating)”或“治疗
(treat)”描述出于对抗疾病
、
病症或障碍的目的而对受试者的管理和护理，并且包括给予本公开的重组融合蛋白或包含它的药用组合物以缓解癌症的症状或并发症，或者消除癌症
。
[0247]
如本文使用的，术语“缓解”意指描述借以降低癌症的体征或症状的严重性的过程
。
重要的是，体征或症状可被缓解而不消除
。
在优选实施方案中，给予本公开的重组融合蛋白或药用组合物导致消除体征或症状，然而，消除不是必要的
。
预期有效剂量将降低体征或症状的严重性
。
例如，如果癌症的严重性在多个位置的至少一个内降低，则可发生在多个位置的障碍比如癌症的体征或症状得到缓解
。
[0248]
如本文使用的，术语“严重性”意指描述癌症从癌前或良性状态转化成恶性状态的潜在性
。
可替换的或另外，严重性意指描述癌症分期，例如根据
tnm
系统
(
由国际抗癌联盟
(international union against cancer)(uicc)
和美国癌症联合委员会
(american joint committee on cancer)(ajcc)
接受的
)
或通过其他的领域公认的方法
。
癌症分期是指基于诸如原发肿瘤的位置
、
肿瘤大小
、
肿瘤数量和淋巴结受累
(
癌症扩散到淋巴结中
)
等因素的癌症程度或严重性
。
可替换的或另外，严重性意指通过领域公认的方法
(
参见美国国家癌症研究院
(national cancer institute)
，
www.cancer.gov)
描述肿瘤分级
。
肿瘤分级为被用于根据癌细胞在显微镜下看起来的异常程度和肿瘤可能生长和扩散的速度而分类癌细胞的系统
。
在确定肿瘤分级时考虑许多因素，包括细胞的结构和生长模式
。
被用于确定肿瘤分级的具体因素随每种类型的癌症而不同
。
严重性还描述组织学分级，也被称为分化，其是指肿瘤细胞与同一组织类型的正常细胞的相似度
(
参见美国国家癌症研究院，
www.cancer.gov)。
此外，严重性描述了核分级，其是指肿瘤细胞中核的大小和形状以及正在分裂的肿瘤细胞百分比
(
参见美国国家癌症研究院，
www.cancer.gov)。
[0249]
如本文使用的，术语“侵袭性”表明可快速地生长
、
形成或扩散的癌症
。
被称为侵袭性的癌症可对治疗敏感，或者它们可抗拒治疗
。
侵袭性癌症可包括任何种类的癌症
。
可替换的或另外，术语“侵袭性”可描述需要比用于该癌症的通常形式的治疗更严厉或强烈治疗的癌症
。
[0250]
如本文使用的，术语“难治性”描述对治疗的尝试形式没有反应的癌症
。
难治性癌症也可被称为抗性癌症
。
[0251]
在本公开的另一个方面，严重性描述肿瘤分泌生长因子
、
降解细胞外基质
、
变为血管化
、
丧失对并置组织的粘附或转移的程度
。
此外，严重性描述原发性肿瘤已经转移到的位置数
。
最后，严重性包括治疗不同类型和位置的肿瘤的难度
。
例如，不宜手术的肿瘤
、
更多进入多个身体系统的那些癌症
(
血液和免疫肿瘤
)
和对传统治疗最具抗性的那些被认为是最严重的
。
在这些情况下，延长受试者的预期寿命和
/
或减少疼痛
、
降低癌细胞的比例或将细胞限制于一个系统和改善癌症分期
/
肿瘤分级
/
组织学分级
/
核分级被认为是缓解癌症的体征或症状
。
[0252]
如本文使用的，术语“症状”被定义为疾病
、
病
、
损伤或在体内不对的某物的指示
。
症状由经历症状的个体感觉或注意到，但可能不易于被其他人注意到
。
其他人被定义为非健康护理专业人员
。
[0253]
如本文使用的，术语“体征”也被定义为在体内不对的某物的指示
。
但体征被定义为医生
、
护士或其他健康护理专业人员可见的事物
。
[0254]
癌症为可引起几乎任何体征或症状的一组疾病
。
体征和症状将取决于癌症的位置
、
癌症的大小和其对附近器官或结构的影响程度
。
如果癌症扩散
(
转移
)
，那么症状可出现在身体的不同部分
。
[0255]
随着癌症生长，其开始推动附近的器官
、
血管和神经
。
该压力产生一些癌症特征和症状
。
癌症可在其中它不引起任何症状的位置形成直至癌症已生长得相当大
。
[0256]
癌症也可引起症状比如发热
、
疲劳或体重减轻
。
这可能是因为癌细胞耗尽大量的身体能量供应或释放改变身体代谢的物质
。
或者癌症可引起免疫系统以产生这些症状的方式作出反应
。
尽管以上列出的体征和症状为对于癌症更常见的，但还有许多其他不太常见并且没有在此处列出的
。
然而，本公开考虑并涵盖所有的领域公认的癌症体征和症状
。
[0257]
治疗癌症可导致肿瘤大小的减小
。
肿瘤大小的减小也可被称为“肿瘤消退”。
优选地，在根据本公开的方法治疗之后，相对于其治疗之前的大小，肿瘤大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小
10
％或更多；更优选地，减小
20
％或更多；更优选地，减小
30
％或更多；更优选地，减小
40
％或更多；甚至更优选地，减小
50
％或更多；和最优选地，减小大于
75
％或更多
。
肿瘤大小可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
肿瘤大小可测量为肿瘤的直径
。
[0258]
治疗癌症可导致肿瘤体积的减小
。
优选地，在根据本公开的方法治疗之后，相对于其治疗之前的大小，肿瘤体积减小5％或更多；更优选地，肿瘤体积减小
10
％或更多；更优选地，减小
20
％或更多；更优选地，减小
30
％或更多；更优选地，减小
40
％或更多；甚至更优选地，减小
50
％或更多；和最优选地，减小大于
75
％或更多
。
肿瘤体积可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
[0259]
治疗癌症可导致肿瘤数量的减少
。
优选地，治疗之后，相对于治疗之前的数量，肿瘤数量减少5％或更多；更优选地，肿瘤数量减少
10
％或更多；更优选地，减少
20
％或更多；更优选地，减少
30
％或更多；更优选地，减少
40
％或更多；甚至更优选地，减少
50
％或更多；和最优选地，减少大于
75
％
。
肿瘤数量可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
肿瘤数量可通过计数肉眼可见或在指定放大率下可见的肿瘤来测量
。
优选地，指定放大率为
2x、3x、4x、5x、10x
或
50x。
[0260]
治疗癌症可导致远离原发肿瘤位点的其他组织或器官中转移性病灶数量的减少
。
优选地，在根据本公开的方法治疗之后，相对于治疗之前的数量，转移性病灶的数量减少5％或更多；更优选地，转移性病灶的数量减少
10
％或更多；更优选地，减少
20
％或更多；更优选地，减少
30
％或更多；更优选地，减少
40
％或更多；甚至更优选地，减少
50
％或更多；和最优选地，减少大于
75
％
。
转移性病灶的数量可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
转移性病灶的数量可通过计数肉眼可见或在指定放大率下可见的转移性病灶来测量
。
优选地，指定放大率为
2x、3x、4x、5x、10x
或
50x。
[0261]
与未接受本公开的重组融合蛋白或包含它的药用组合物的群体相比较，治疗癌症可导致所治疗的受试者群体的平均存活时间增加
。
优选地，平均存活时间增加多于
30
天；更优选地，多于
60
天；更优选地，多于
90
天；并且最优选地，多于
120
天
。
群体平均存活时间的增加可通过任何可再现的手段进行测量
。
群体平均存活时间的增加可例如通过对群体计算在用活性化合物开始治疗后的平均存活长度来测量
。
群体平均存活时间的增加还可例如通过对群体计算在完成用活性化合物的第一轮治疗后的平均存活长度来测量
。
[0262]
与未接受本公开的重组融合蛋白或包含它的药用组合物的群体相比较，治疗癌症可导致所治疗的受试者群体的死亡率降低
。
与未治疗的群体相比较，治疗癌症可导致所治疗的受试者群体的死亡率降低
。
与接受不是本公开的重组融合蛋白或药用组合物的药物的单一疗法的群体相比较，治疗癌症可导致所治疗的受试者群体的死亡率降低
。
所治疗的受试者群体的死亡率降低可通过任何可再现的手段进行测量
。
群体的死亡率降低可例如通过对群体计算在用活性化合物开始治疗后的每单位时间的疾病相关死亡的平均数量来测量
。
群体的死亡率降低也可例如通过对群体计算在完成用重组融合蛋白的第一轮治疗后的每单位时间的疾病相关死亡的平均数量来测量
。
[0263]
治疗癌症可导致肿瘤生长速率的降低
。
优选地，在治疗之后，相对于治疗之前的数量，肿瘤生长速率减少至少5％；更优选地，肿瘤生长速率减少至少
10
％；更优选地，至少减少
20
％；更优选地，减少至少
30
％；更优选地，减少至少
40
％；更优选地，减少至少
50
％；甚至更优选地，减少至少
50
％；和最优选地，减少至少
75
％
。
肿瘤生长速率可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
肿瘤生长速率可根据每单位时间的肿瘤直径变化来测量
。
[0264]
治疗癌症可导致肿瘤再生长的减少
。
优选地，在治疗之后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于
10
％；更优选地，小于
20
％；更优选地，小于
30
％；更优选地，小于
40
％；更优选地，小于
50
％；甚至更优选地，小于
50
％；和最优选地，小于
75
％
。
肿瘤再生长可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
肿瘤再生长例如通过测量在治疗后先前肿瘤缩小之后肿瘤直径的增加来测量
。
肿瘤再生长的减少通过治疗停止之后肿瘤未复发来指示
。
[0265]
治疗癌症可导致细胞增殖速率的降低
。
优选地，在治疗之后，细胞增殖速率减少至少5％；更优选地，至少
10
％；更优选地，至少
20
％；更优选地，至少
30
％；更优选地，至少
40
％；更优选地，至少
50
％；甚至更优选地，至少
50
％；和最优选地，至少
75
％
。
细胞增殖速率可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
细胞增殖速率例如通过测量每单位时间的组织样品中分裂细胞的数量来测量
。
[0266]
治疗癌症可导致增殖细胞的比例减少
。
优选地，在治疗之后，增殖细胞的比例减少至少5％；更优选地，至少
10
％；更优选地，至少
20
％；更优选地，至少
30
％；更优选地，至少
40
％；更优选地，至少
50
％；甚至更优选地，至少
50
％；和最优选地，至少
75
％
。
增殖细胞的比例可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
优选地，增殖细胞的比例例如通过相对于组织
样品中非分裂细胞的数量量化分裂细胞的数量来测量
。
增殖细胞的比例可等同于有丝分裂指数
。
[0267]
治疗癌症可导致细胞增殖面积或区域的大小减少
。
优选地，在治疗之后，相对于其治疗之前的大小，细胞增殖面积或区域的大小减少至少5％；更优选地，减少至少
10
％；更优选地，减少至少
20
％；更优选地，减少至少
30
％；更优选地，减少至少
40
％；更优选地，减少至少
50
％；甚至更优选地，减少至少
50
％；和最优选地，减少至少
75
％
。
细胞增殖面积或区域的大小可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
细胞增殖面积或区域的大小可测量为细胞增殖面积或区域的直径或宽度
。
[0268]
治疗癌症可导致具有异常外观或形态学的细胞数量或比例减少
。
优选地，在治疗之后，相对于其治疗之前的大小，具有异常形态学的细胞数量减少至少5％；更优选地，减少至少
10
％；更优选地，减少至少
20
％；更优选地，减少至少
30
％；更优选地，减少至少
40
％；更优选地，减少至少
50
％；甚至更优选地，减少至少
50
％；和最优选地，减少至少
75
％
。
异常细胞外观或形态学可通过任何可再现的测量手段进行测量
。
异常细胞形态学可通过显微术，例如使用倒置组织培养显微镜来测量
。
异常细胞形态学可采取核多形性的形式
。
[0269]
治疗癌症可导致细胞死亡，并且优选地，细胞死亡导致群体中的细胞数量减少至少
10
％
。
更优选地，细胞死亡意指减少至少
20
％；更优选地，减少至少
30
％；更优选地，减少至少
40
％；更优选地，减少至少
50
％；最优选地，减少至少
75
％
。
群体中的细胞数量可通过任何可再现的方法测量
。
群体中的细胞数量可通过荧光激活细胞分选
(facs)、
免疫荧光显微术和光学显微术来测量
。
测量细胞死亡的方法如
li
等人，
proc natlacadsci usa.100(5):2674-8,2003
中所示
。
在一个方面，细胞死亡通过细胞凋亡而发生
。
[0270]
组合疗法
[0271]
在一些实施方案中，可期望结合重组融合蛋白或包含它的药用组合物来给予另外的癌症治疗
。
例如，在一些治疗方案中，化学治疗剂
、
抗生素
、
包含本发明的重组融合蛋白和一种或多种标准护理剂等的另外制剂均任选地被包括在本发明的组合物中
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白与化学疗法
、
小分子抑制剂
、
蛋白基或生物疗法
、
放射疗法
、
手术
、
免疫疗法或过继细胞疗法中的一种或多种组合给予
。
[0272]
如本文使用的，术语“组合治疗”、“组合疗法”和“共同疗法”可互换地使用，并且通常是指特征为如本文提供的重组融合蛋白或包含它的药用组合物和另外的治疗剂或方法的治疗形式
。
一般地，组合治疗形式为预期提供来自治疗剂组合的并行作用的有益效果的特定治疗方案的一部分
。
组合的有益效果可包括但不限于由治疗剂的组合产生的药代动力学或药效学共同作用
。
一般地在限定的时间段
(
取决于选择的组合通常为数分钟
、
数小时
、
数天或数周
)
内进行组合给予这些治疗剂
。
在一些实施方案中，组合治疗包括以依序方式给予两种或更多种治疗剂，其中在不同时间给予每种治疗剂，以及以基本上同时的方式给予这些治疗剂或者治疗剂中的至少两种
。
可例如通过给予受试者具有固定比率的每种治疗剂的单一剂型或以治疗剂的多个分别的剂型来完成基本上同时给予
。
可通过包括但不限于以下的任何适当途径来实现每种治疗剂的依序或基本上同时给予：口服途径
、
静脉内途径
、
肌内途径和通过粘膜组织的直接吸收
。
可通过相同途径或通过不同途径给予治疗剂
。
可根据相同或不同的给予间隔给予治疗剂
。
例如，可通过静脉内注射给予选择的组合的第一治疗剂，而组合的其他治疗剂可口服给予
。
可替换的，例如，可口服给予所有治疗剂或者可通过
静脉内注射给予所有治疗剂
。
[0273]
在一些实施方案中，组合疗法还包括与其他生物活性成分和非药物疗法
(
例如手术或放射治疗
)
进一步组合给予如上所述的治疗剂
。
在组合疗法进一步包含非药物治疗的情况下，可在任何合适的时间进行非药物治疗，只要来自治疗剂与非药物治疗的组合的共同作用的有益效果得以实现即可
。
例如，在适当情况下，当从治疗剂的给予中暂时地去除非药物治疗时
(
也许是数天甚至数周
)
，仍然实现有益效果
。
[0274]
在一些实施方案中，另外的治疗剂为化学治疗剂
(
也被称为抗肿瘤剂或抗增殖剂
)
，例如烷化剂；抗生素；抗代谢物；解毒剂；干扰素；多克隆或单克隆抗体；
egfr
抑制剂；
her2
抑制剂；组蛋白去乙酰化酶抑制剂；激素；有丝分裂抑制剂；
mtor
抑制剂；多激酶抑制剂；丝氨酸
/
苏氨酸激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；
vegf/vegfr
抑制剂；紫杉烷或紫杉烷衍生物
、
芳香化酶抑制剂
、
蒽环类药物
(anthracycline)、
微管靶向药物
、
拓扑异构酶毒性药物
、
分子靶标或酶
(
例如激酶或蛋白甲基转移酶
)
的抑制剂
、
胞苷类似物药物或任何化学治疗剂
、
免疫检查点抑制剂
、
铂基抗肿瘤剂
、cdk
抑制剂
、parp
抑制剂或本领域技术人员已知的任何抗肿瘤或抗增殖剂
。
[0275]
适合于根据本文提供的组合治疗方式使用的示例性烷化剂包含但不限于环磷酰胺
(cytoxan
；
neosar)
；苯丁酸氮芥
(leukeran)
；美法仑
(alkeran)
；卡莫司汀
(bicnu)
；白消安
(busulfex)
；洛莫司汀
(ceenu)
；达卡巴嗪
(dtic-dome)
；奥沙利铂
(eloxatin)
；卡莫司汀
(gliadel)
；异环磷酰胺
(ifex)
；氮芥
(mechlorethamine)(mustargen)
；白消安
(myleran)
；卡铂
(paraplatin)
；顺铂
(cddp
；
platinol)
；替莫唑胺
(temodar)
；噻替哌
(thioplex)
；苯达莫司汀
(treanda)
；或链佐星
(zanosar)。
[0276]
示例性的合适的蒽环类药物包括但不限于多柔比星
(
阿霉素
)
；多柔比星脂质体
(doxil)
；米托蒽醌
(novantrone)
；博莱霉素
(blenoxane)
；柔红霉素
(cerubidine)
；柔红霉素脂质体
(daunoxome)
；放线菌素
d(cosmegen)
；表柔比星
(ellence)
；伊达比星
(idamycin)
；普卡霉素
(mithracin)
；丝裂霉素
(mutamycin)
；喷司他丁
(nipent)
；或戊柔比星
(valstar)。
[0277]
示例性的抗代谢物包括但不限于氟尿嘧啶
(adrucil)
；卡培他滨
(xeloda)
；羟基脲
(hydrea)
；巯基嘌呤
(purinethol)
；培美曲塞
(alimta)
；氟达拉滨
(fludara)
；奈拉滨
(arranon)
；克拉屈滨
(cladribine novaplus)
；氯法拉滨
(clolar)
；阿糖胞苷
(cytosar-u)
；地西他滨
(dacogen)
；阿糖胞苷脂质体
(depocyt)
；羟基脲
(droxia)
；普拉曲沙
(folotyn)
；氟尿苷
(fudr)
；吉西他滨
(gemzar)
；克拉屈滨
(leustatin)
；氟达拉滨
(oforta)
；甲氨蝶呤
(mtx
；
rheumatrex)
；甲氨蝶呤
(trexall)
；硫鸟嘌呤
(tabloid)
；
ts-1
或阿糖胞苷
(tarabine pfs)。
[0278]
示例性的解毒剂包括但不限于氨磷汀
(ethyol)
或美司钠
(mesnex)。
[0279]
示例性的干扰素包括但不限于干扰素
α-2b(
内含子
a)
或干扰素
α-2a(
罗扰素
(roferon)-a)。
[0280]
示例性的多克隆或单克隆抗体包括但不限于曲妥珠单抗
(herceptin)
；奥法木单抗
(arzerra)
；贝伐珠单抗
(avastin)
；利妥昔单抗
(rituxan)
；西妥昔单抗
(erbitux)
；帕尼单抗
(vectibix)
；托西莫单抗
/
碘-131
托西莫单抗
(bexxar)
；阿仑单抗
(campath)
；替伊莫单抗
(zevalin
；
in-111
；
y-90zevalin)
；吉妥珠单抗
(mylotarg)
；依库丽单抗
(soliris)
或地诺单抗
。
[0281]
示例性的
egfr
抑制剂包括但不限于吉非替尼
(iressa)
；拉帕替尼
(tykerb)
；西妥昔单抗
(erbitux)
；厄洛替尼
(tarceva)
；帕尼单抗
(vectibix)
；
pki-166
；卡奈替尼
(ci-1033)
；马妥珠单抗
(emd 72000)
或
ekb-569。
[0282]
示例性的
her2
抑制剂包括但不限于曲妥珠单抗
(herceptin)
；拉帕替尼
(tykerb)
或
ac-480。
[0283]
组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括但不限于伏立诺他
(zolinza)。
[0284]
示例性的激素包括但不限于他莫昔芬
(soltamox
；
nolvadex)
；雷洛昔芬
(evista)
；甲地孕酮
(megace)
；亮丙瑞林
(lupron
；
lupron depot
；
eligard
；
viadur)
；氟维司群
(faslodex)
；来曲唑
(femara)
；曲普瑞林
(trelstar la
；
trelstardepot)
；依西美坦
(aromasin)
；戈舍瑞林
(zoladex)
；比卡鲁胺
(casodex)
；阿那曲唑
(arimidex)
；氟甲睾酮
(androxy
；
halotestin)
；甲羟孕酮
(provera
；
depo-provera)
；雌莫司汀
(emcyt)
；氟他胺
(eulexin)
；托瑞米芬
(fareston)
；地加瑞克
(firmagon)
；尼鲁米特
(nilandron)
；阿巴瑞克
(plenaxis)
；或睾内酯
(teslac)。
[0285]
示例性的有丝分裂抑制剂包括但不限于紫杉醇
(taxol
；
onxol
；
abraxane)
；多西他赛
(taxotere)
；长春新碱
(oncovin
；
vincasarpfs)
；长春碱
(velban)
；依托泊苷
(toposar
；
etopophos
；
vepesid)
；替尼泊苷
(vumon)
；伊沙匹隆
(ixempra)
；诺考达唑；埃博霉素；长春瑞滨
(navelbine)
；喜树碱
(cpt)
；伊立替康
(camptosar)
；托泊替康
(hycamtin)
；安吖啶或片螺素
d(lam-d)。
[0286]
示例性的
mtor
抑制剂包括但不限于依维莫司
(afinitor)
或坦罗莫司
(torisel)
；雷帕鸣
(rapamune)、
地磷莫司
(ridaforolimus)
；或
ap23573。
[0287]
示例性的多激酶抑制剂包括但不限于索拉非尼
(nexavar)
；舒尼替尼
(sutent)
；
bibw2992
；
e7080
；
zd6474
；
pkc-412
；莫替沙尼
(motesanib)
；或
ap24534。
[0288]
示例性的丝氨酸
/
苏氨酸激酶抑制剂包括但不限于鲁伯斯塔
(ruboxistaurin)
；依立卢
/
盐酸法舒地尔；夫拉平度
(flavopiridol)
；塞利西利
(seliciclib)(cyc202
；
roscovitine)
；
sns-032(bms-387032)
；
pkc412
；苔藓抑素；
kai-9803
；
sf1126
；
vx-680
；
azd1152
；
arry-142886(azd-6244)
；
scio-469
；
gw681323
；
cc-401
；
cep-1347
或
pd 332991。
[0289]
示例性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于厄洛替尼
(tarceva)
；吉非替尼
(iressa)
；伊马替尼
(gleevec)
；索拉非尼
(nexavar)
；舒尼替尼
(sutent)
；曲妥珠单抗
(herceptin)
；贝伐珠单抗
(avastin)
；利妥昔单抗
(rituxan)
；拉帕替尼
(tykerb)
；西妥昔单抗
(erbitux)
；帕尼单抗
(vectibix)
；依维莫司
(afinitor)
；阿仑单抗
(campath)
；吉妥珠单抗
(mylotarg)
；坦罗莫司
(torisel)
；帕唑帕尼
(votrient)
；达沙替尼
(sprycel)
；尼洛替尼
(tasigna)
；瓦他拉尼
(ptk787
；
zk222584)
；
cep-701
；
su5614
；
mln518
；
xl999
；
vx-322
；
azd0530
；
bms-354825
；
ski-606cp-690
；
ag-490
；
whi-p154
；
whi-p131
；
ac-220
；或
amg888。
[0290]
示例性的
vegf/vegfr
抑制剂包括但不限于贝伐珠单抗
(avastin)、
索拉非尼
(nexavar)、
舒尼替尼
(sutent)、
雷珠单抗
、
培加他尼或凡德替尼
。
[0291]
示例性的微管靶向药物包括但不限于紫杉醇
、
多西他赛
、
长春新碱
、
长春碱
、
诺考达唑
、
埃博霉素和诺维本
(navelbine)。
[0292]
示例性的拓扑异构酶毒性药物包括但不限于替尼泊苷
、
依托泊苷
、
阿霉素
、
喜树碱
、
柔红霉素
、
放线菌素
d、
米托蒽醌
、
安吖啶
、
表柔比星和伊达比星
。
[0293]
示例性的紫杉烷或紫杉烷衍生物包括但不限于紫杉醇和多西他赛
。
[0294]
示例性的免疫检查点抑制剂包括程序性细胞死亡
1(pd-1)
和
cd274
分子
(pd-l1)
抑制剂
。
示例性的
pd-1
抑制剂包括帕博利珠单抗
(pembrolizumab)、
纳武单抗
(nivolumab)
和西米普利单抗
(cemiplimab)。pd-1
抑制剂的进一步实例包括瑞弗利单抗
(retifanlimab)、
斯巴达珠单抗
(spartalizumab)、
卡瑞利珠单抗
(camrelizumab)、
替雷利珠单抗
(tislelizumab)、
特瑞普利单抗
(toripalimab)
和多塔利单抗
(dostarlimab)。
示例性的
pd-l1
抑制剂包括阿特珠单抗
(atezolizumab)、
阿维单抗
(avelumab)
和度伐利尤单抗
(durvalumab)。pd-l1
抑制剂的进一步实例包括恩弗利单抗
(enfavolimab)。
[0295]
示例性的铂基抗肿瘤剂包括顺铂和卡铂
。
[0296]
示例性的细胞周期蛋白依赖性激酶
(cdk)
抑制剂包括阿贝西利
(abemaciclib)、
哌柏西利
(palbociclib)
和瑞博西利
(ribociclib)。
[0297]
示例性的聚
(adp
核糖
)
聚合酶
(parp)
抑制剂包括他拉唑帕利
(talazoparib)、
奥拉帕利
(olaparib)、
卢卡帕利
(rucaparib)、
尼拉帕利
(niraparib)
和维利帕利
(veliparib)。
[0298]
示例性的一般化学治疗剂
、
抗肿瘤剂
、
抗增殖剂包括但不限于六甲蜜胺
(hexalen)
；异维甲酸
(accutane
；
amnesteem
；
claravis
；
sotret)
；维甲酸
(vesanoid)
；阿扎胞苷
(vidaza)
；硼替佐米
(velcade)
；天冬酰胺酶
(elspar)
；左旋咪唑
(ergamisol)
；米托坦
(lysodren)
；丙卡巴肼
(matulane)
；培门冬酶
(oncaspar)
；地尼白介素
(denileukin diftitox)(ontak)
；卟吩姆
(photofrin)
；阿地白介素
(proleukin)
；来那度胺
(revlimid)
；贝沙罗汀
(targretin)
；沙利度胺
(thalomid)
；坦罗莫司
(torisel)
；三氧化二砷
(trisenox)
；维替泊芬
(visudyne)
；含羞草素
(leucenol)
；
(1m
替加氟-0.4m 5-氯-2,4-二羟基嘧啶-1m
氧嗪酸钾
)
或洛伐他汀
。
[0299]
小分子抑制剂是指由于其小而可被用于靶向由癌细胞表达的细胞外和细胞内蛋白两者的药物
。
小分子抑制剂靶向丝氨酸
/
苏氨酸
/
酪氨酸激酶
、
基质金属蛋白酶
(mmp)、
热休克蛋白
(hsp)、
蛋白酶体和其他在信号转导通路中发挥作用的蛋白
。
示例性的小分子抑制剂包括阿昔替尼
(acitinib)、
厄洛替尼
、
伊马替尼
、
吉非替尼
、
舒尼替尼
、
拉帕替尼
、
尼洛替尼
(nolitinib)、
卡博替尼
、
克唑替尼
、
索拉非尼
、
维罗非尼
、
曲美替尼
、
依维莫司
、
坦罗莫司
(temisorolimus)、
鲁索利替尼
(ruxolitinib)、
硼替佐米
、
帕唑帕尼
、
鲁索利替尼
(ruzolitinib)、
凡德他尼
(vandetenib)、
博苏替尼
、
卡博替尼
、
普纳替尼
(ponatinib)、
瑞戈非尼
(regorafenib)、
依鲁替尼
(ibrutinib)、
曲美替尼
、
哌立福辛
(perifosine)、
巴马司他
(batimistat)、
新伐司他
(neovastat)、
普马司他
(prinomastat)、
瑞马司他
(rebimastat)、
加特司匹
(ganetespib)、
马立马司他
(marimastat)、
奥巴克拉
(obatoclax)、
纳维托克
(navitoclax)
和卡非佐米
。
[0300]
蛋白或生物基疗法是指包括给予治疗性蛋白
、
细胞
、
载体或疫苗的疗法
。
示例性的生物基疗法包括但不限于抗体疗法和过继细胞疗法，比如嵌合抗原受体
t
细胞
(car-t)
或
t
细胞受体
t
细胞
(tcr-t)
疗法
。
示例性的抗体疗法包括但不限于免疫检查点抑制剂，比如
pd-1
检查点的抑制剂
(
纳武单抗
、
帕博利珠单抗
、
阿特珠单抗
、
阿维单抗
、
度伐利尤单抗
、
西米普利单抗
)
，针对生长因子比如
egfr(
西妥昔单抗
、
帕尼单抗
、
尼妥珠单抗
、
耐昔妥珠单抗
)
或
her2(
曲妥珠单抗
、
帕妥珠单抗
)
的抗体，以及针对癌症抗原的抗体
(
例如利妥昔单抗
、
本妥昔单抗
、
吉妥珠单抗
、
替伊莫单抗
、
博纳吐单抗
、
奥英妥珠单抗等
)。
示例性的载体包括但不
限于可被用于递送编码治疗性蛋白的核酸的载体，比如腺相关
(aav)
和慢病毒载体
。
示例性的疫苗包括癌症疫苗
。
[0301]
在一些实施方案中，提供组合治疗方式，其中另外的治疗剂为细胞因子，例如
g-csf(
粒细胞集落刺激因子
)。
[0302]
在一些实施方案中，本文提供的药用组合物可与放射疗法组合给予
。
放射疗法还可与本文提供的药用组合物和本文所述的另一种化学治疗剂组合作为多治疗剂疗法的一部分给予
。
在仍然另一个方面，本文提供的药用组合物可与以下标准化学疗法组合给予，比如但不限于：
cmf(
环磷酰胺
、
甲氨蝶呤和
5-氟尿嘧啶
)、caf(
环磷酰胺
、
阿霉素和
5-氟尿嘧啶
)、ac(
阿霉素和环磷酰胺
)、fec(5-氟尿嘧啶
、
表柔比星和环磷酰胺
)、act
或
atc(
阿霉素
、
环磷酰胺和紫杉醇
)、
利妥昔单抗
、
希罗达
(
卡培他滨
)、
顺铂
(cddp)、
卡铂
、ts-1(
摩尔比为
1:0.4:1
的替加氟
、
吉莫斯特和奥替拉西钾
(otastatpotassium))、
喜树碱-11(cpt-11、
伊立替康或
camptosar
tm
)、chop(
环磷酰胺
、
羟基柔红霉素
、
安可平和泼尼松或泼尼松龙
)、r-chop(
利妥昔单抗
、
环磷酰胺
、
羟基柔红霉素
、
安可平
、
泼尼松或泼尼松龙
)
或
cmfp(
环磷酰胺
、
甲氨蝶呤
、5-氟尿嘧啶和泼尼松
)。
[0303]
在一些优选实施方案中，本文提供的药用组合物可与酶比如受体或非受体激酶的抑制剂一起给予
。
受体和非受体激酶为例如酪氨酸激酶或丝氨酸
/
苏氨酸激酶
。
本文所述的激酶抑制剂为小分子
、
多核酸
、
多肽或抗体
。
[0304]
示例性的激酶抑制剂包括但不限于贝伐珠单抗
(
靶标
vegf)、bibw2992(
靶标
egfr
和
erb2)、
西妥昔单抗
/
爱必妥
(erbitux)(
靶标
erb1)、
伊马替尼
/
格列卫
(gleevec)(
靶标
bcr-abl)、
曲妥珠单抗
(
靶标
erb2)、
吉非替尼
/
易瑞沙
(iressa)(
靶标
egfr)、
雷珠单抗
(
靶标
vegf)、
培加他尼
(
靶标
vegf)、
厄洛替尼
/
特罗凯
(tarceva)(
靶标
erb1)、
尼洛替尼
(
靶标
bcr-abl)、
拉帕替尼
(
靶标
erb1
和
erb2/her2)、gw-572016/
拉帕替尼二甲苯磺酸盐
(
靶标
her2/erb2)、
帕尼单抗
/
维必施
(vectibix)(
靶标
egfr)、
凡德替尼
(
靶标
ret/vegfr)、e7080(
包括
ret
和
vegfr
的多个靶标
)、
赫赛汀
(
靶标
her2/erb2)、pki-166(
靶标
egfr)、
卡奈替尼
/ci-1033(
靶标
egfr)、
舒尼替尼
/su-11464/
索坦
(sutent)(
靶标
egfr
和
flt3)、
马妥珠单抗
/emd7200(
靶标
egfr)、ekb-569(
靶标
egfr)、zd6474(
靶标
egfr
和
vegfr)、pkc-412(
靶标
vegr
和
flt3)、
瓦他拉尼
/ptk787/zk222584(
靶标
vegr)、cep-701(
靶标
flt3)、su5614(
靶标
flt3)、mln518(
靶标
flt3)、xl999(
靶标
flt3)、vx-322(
靶标
flt3)、azd0530(
靶标
src)、bms-354825(
靶标
src)、ski-606(
靶标
src)、cp-690(
靶标
jak)、ag-490(
靶标
jak)、whi-p154(
靶标
jak)、whi-p131(
靶标
jak)、
索拉非尼
/
多吉美
(nexavar)(
靶标
raf
激酶
、vegfr-1、vegfr-2、vegfr-3、pdgfr-β
、kit、flt-3
和
ret)、
达沙替尼
/
施达赛
(sprycel)(bcr/abl
和
src)、ac-220(
靶标
flt3)、ac-480(
靶标所有
her
蛋白
、“泛
her”)、
二磷酸莫替沙尼
(
靶标
vegf1-3、pdgfr
和
c-kit)、
地诺单抗
(
靶标
rankl
，抑制
src)、amg888(
靶标
her3)
和
ap24534(
包括
flt3
的多个靶标
)。
[0305]
在一些实施方案中，重组融合蛋白或包含它的药用组合物与过继细胞疗法组合给予
。
在一些实施方案中，过继细胞疗法为嵌合抗原受体
t
细胞
(cart)、tcrt
细胞疗法或
carnk
细胞疗法
。
[0306]
如本文使用的，术语“嵌合抗原受体
(car)”是指包含以下的人工跨膜蛋白受体：(i)能够与至少一种预定的
car
配体或抗原结合的细胞外结构域，
(ii)
细胞内区段，其包含
源于不同于细胞外结构域所源于的多肽的信号转导蛋白的一个或多个细胞质结构域，和
(iii)
跨膜结构域
。
许多不同的
car
为本领域已知的，认为其全部处于本发明的范围内
。
[0307]
如本文使用的，
tcrt
细胞疗法是指被设计改造为表达能够与至少一种预定的
tcr
配体或抗原结合的
tcr
的
t
细胞
。
许多不同的
tcr
为本领域已知的，认为其全部处于本发明的范围内
。
[0308]
在一些实施方案中，每天
、
每2天
、
每3天
、
每4天
、
每5天
、
每6天
、
每7天
、
每8天
、
每9天
、
每
10
天
、
每
11
天
、
每
12
天
、
每
13
天
、
每2周
、
每3周
、
每4周
、
每5周
、
每6周
、
每7周
、
每8周
、
每9周
、
每
10
周
、
每
11
周
、
每
12
周
、
每
13
周
、
每2个月
、
每3个月或每4个月给予受试者包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0309]
在一些实施方案中，每天
、
每2天
、
每3天
、
每4天
、
每5天
、
每6天
、
每7天
、
每8天
、
每9天
、
每
10
天
、
每两周
、
每三周或每月给予受试者包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0310]
在一些实施方案中，每天一次给予受试者包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每两天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每三天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每四天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每五天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每六天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每七天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每八天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每九天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每十天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每十一天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每十二天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每十三天给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每两周给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每三周给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，每月给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，一年两次或更多次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每两年两次或更多次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每两年或更多年两次或更多次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0311]
在一些实施方案中，每
7-14
天一次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每
10-20
天一次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每
5-15
天一次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每
15-30
天一次给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0312]
在一些实施方案中，每
36
小时至少一次给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每
48
小时至少一次给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每
60
小时至少一次给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，每
72
小时至少一次给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，
1.0mg/kg、100
μ
g/kg-0.5mg/kg、100
μ
g/kg-0.3mg/kg
或
100
μ
g/kg-200
μ
g/kg
的剂量给予包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0317]
在一些实施方案中，以
0.01
μ
g/kg-2.0mg/kg
的剂量给予包含
ctla-4
抗原结合结构域
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
结构域的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
0.1
μ
g/kg-1.0mg/kg
的剂量给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
1.0
μ
g/kg-0.5mg/kg
的剂量给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
10
μ
g/kg-300
μ
g/kg
的剂量给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
50
μ
g/kg-200
μ
g/kg
的剂量给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
100
μ
g/kg-200
μ
g/kg
的剂量给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0318]
在一些实施方案中，以
10
μ
g-500mg、10
μ
g-400mg、10
μ
g-300mg、10
μ
g-200mg、10
μ
g-100mg、10
μ
g-75mg、10
μ
g-50mg、10
μ
g-40mg、10
μ
g-30mg、10
μ
g-20mg、10
μ
g-10mg、100
μ
g-500mg、100
μ
g-400mg、100
μ
g-300mg、100
μ
g-200mg、100
μ
g-100mg、100
μ
g-50mg、100
μ
g-40mg、100
μ
g-30mg、100
μ
g-20mg、100
μ
g-10mg、300
μ
g-500mg、300
μ
g-400mg、300
μ
g-300mg、300
μ
g-200mg、300
μ
g-100mg、300
μ
g-50mg、300
μ
g-40mg、300
μ
g-30mg、300
μ
g-20mg、300
μ
g-10mg、500
μ
g-500mg、500
μ
g-400mg、500
μ
g-300mg、500
μ
g-200mg、500
μ
g-100mg、500
μ
g-50mg、500
μ
g-40mg、500
μ
g-30mg、500
μ
g-20mg、500
μ
g-10mg、600
μ
g-500mg、600
μ
g-400mg、600
μ
g-300mg、600
μ
g-200mg、600
μ
g-100mg、600
μ
g-50mg、600
μ
g-40mg、600
μ
g-30mg、600
μ
g-20mg、600
μ
g-10mg、700
μ
g-500mg、700
μ
g-700mg、700
μ
g-300mg、700
μ
g-200mg、700
μ
g-100mg、700
μ
g-50mg、700
μ
g-40mg、700
μ
g-30mg、700
μ
g-20mg、700
μ
g-10mg、800
μ
g-500mg、800
μ
g-400mg、800
μ
g-300mg、800
μ
g-200mg、800
μ
g-100mg、800
μ
g-50mg、800
μ
g-40mg、800
μ
g-30mg、800
μ
g-20mg、800
μ
g-10mg、1mg-500mg、1mg-400mg、1mg-300mg、1mg-200mg、1mg-100mg、1mg-50mg、1mg-40mg、1mg-30mg、1mg-20mg、1mg-10mg、5mg-500mg、5mg-400mg、5mg-300mg、5mg-200mg、5mg-100mg、5mg-50mg、5mg-40mg、5mg-30mg、5mg-20mg、5mg-10mg、10mg-500mg、10mg-400mg、10mg-300mg、10mg-200mg、10mg-100mg、10mg-50mg、20mg-500mg、20mg-300mg、20mg-200mg、5mg-100mg
或
20mg-50mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0319]
在一些实施方案中，以
0.05
μ
g-1,000mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以5μ
g-1,000mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
50
μ
g-500mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
50
μ
g-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
100
μ
g-500mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
100
μ
g-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-1000mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
1mg-500mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
1mg-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-50mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白
或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-40mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-36mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-30mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
500
μ
g-20mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
700
μ
g-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
700
μ
g-50mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
700
μ
g-40mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
700
μ
g-36mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
700
μ
g-30mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
700
μ
g-20mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的组合物
。
在一些实施方案中，以
800
μ
g-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
800
μ
g-50mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
5mg-1,000mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
10mg-500mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，以
10mg-100mg
范围内的剂量给予受试者重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
[0320]
在一个实施方案中，给予受试者单个一次剂量的重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在另一个实施方案中，给予受试者总共两个剂量
。
在另一个实施方案中，给予受试者总共两个或更多个剂量
。
在一些实施方案中，以单次注射给予单个剂量
。
在一些实施方案中，以多次注射，例如
1、2、3、4
或更多次注射给予单个剂量
。
[0321]
在一些实施方案中，通过静脉内
、
动脉内
、
皮下
、
瘤内或肌内注射液体制剂给予重组融合蛋白或包含它的药用组合物
。
在一些实施方案中，液体制剂包括溶液剂
、
悬浮剂
、
分散体
、
乳剂
、
油剂等
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物静脉内给予，并且因此以适合于静脉内给予的形式进行配制
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物动脉内给予，并且因此以适合于动脉内给予的形式进行配制
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物皮下给予，并且因此以适合于皮下给予的形式进行配制
。
在一些实施方案中，重组融合蛋白或药用组合物瘤内给予，并且因此以适合于瘤内给予的形式进行配制
。
[0322]
在一些实施方案中，用于本文公开的方法的组合物包括溶液剂或乳剂，其在一些实施方案中为包含安全和有效量的本文公开的化合物以及任选地预期用于静脉内或皮下给予的其他化合物的水性溶液剂或乳剂
。
[0323]
在一些实施方案中，给予本文所述的重组融合蛋白或包含它的药用组合物不会显著地增加来自受试者的外周血样品中干扰素
γ
(ifn
γ
)
的水平
。
在一些实施方案中，给予本公开的重组融合蛋白或包含的药用组合物增加的来自受试者的外周血样品中干扰素
γ
(ifn
γ
)
的水平少于给予等摩尔量的
il-15
或与
il-15ra sushi
结构域复合的
il-15。
在一些实施方案中，外周血样品包含全血
。
在一些实施方案中，外周血样品包含血浆
。
在一些实施方案中，外周血样品包含血清
。
[0324]
在一些实施方案中，给予本文所述的重组融合蛋白或包含它的药用组合物在受试者中增加免疫细胞的增殖
。
可替换的或另外，给予本文所述的重组融合蛋白或包含它的药
用组合物在受试者中增加免疫细胞的数量
。
免疫细胞的数量可受到免疫细胞存活
、
增殖或其组合的影响
。
可替换的或另外，给予本文所述的重组融合蛋白或包含它的药用组合物在受试者中增加活性免疫细胞的数量
。
在一些实施方案中，在受试者中，免疫细胞的增殖
、
存活
、
活性或数量增加而基本上不增加
ifn
γ
的水平
。
在一些实施方案中，免疫细胞包括自然杀伤
(nk)
细胞
。
在一些实施方案中，免疫细胞包括
t
细胞，例如
cd8+t
细胞
。
在一些实施方案中，免疫细胞包括
nk
细胞和
t
细胞的组合
。
免疫细胞数量的增加可在给予本文所述的重组融合蛋白和药用组合物之后持续至少
2、3、4、5、6、7
或更多天
。
[0325]
测定细胞因子比如
il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、tnf
α
和
ifn
γ
的水平的方法将为本领域普通技术人员已知的，并且尤其是包括免疫测定，比如对从受试者抽取的全血或血浆样品的
elisa
测定
。
对
ifn
γ
的测试为本领域已知的并且为市售可获得的
。
示例性的测试包括
quantiferon-tb gold(qft)
测试
。ifn
γ
的基线水平因测试而异，并且可通过对测试有特异性的参考样品设置
。
然而，对于健康受试者而言，低于2皮克
(p)/ml、
低于
3pg/ml、
低于
5pg/ml
或低于
10pg/ml
的水平通常被认为处于
ifn
γ
的正常范围内
。
因此，在给予重组融合蛋白和包含它的药用组合物之后，低于
3pg/ml、
低于
5pg/ml、
低于
10pg/ml
或低于
20pg/ml
的
ifn
γ
水平被认为不是
ifn
γ
的显著增加
。
类似地，超过给予本文所述的重组融合蛋白和药用组合物之前测量的
ifn
γ
基线水平小于
1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9
或2倍的
ifn
γ
增加不是
ifn
γ
的显著增加
。
对
il-6
的测试为本领域类似已知的，并且为市售可获得的，例如来自
questdiagnostics。
[0326]
在一些实施方案中，在给予本文所述重组融合蛋白或包含它的药用组合物之前测量
ifn
γ
水平以建立基线，并且然后在给予本文所述重组融合蛋白或药用组合物之后测定
ifn
γ
水平在给予后已增加的量
。
在一些实施方案中，在给予本文所述重组融合蛋白或药用组合物之后约1小时
、2
小时
、2
小时
、3
小时
、5
小时
、6
小时
、8
小时
、10
小时
、12
小时
、14
小时
、16
小时
、18
小时
、20
小时
、24
小时
、36
小时
、48
小时或
72
小时或其组合测量
ifn
γ
的水平
。
[0327]
或者，给予本文所述融合蛋白后的
ifn
γ
水平可与给予缺乏抗
ctla-4
抗原结合结构域的类似
il-15ra sushi/il-15
融合蛋白进行比较
。
在一些实施方案中，给予受试者本公开融合蛋白增加的受试者
ifn
γ
水平低于给予缺乏抗
ctla-4
抗原结合结构域的类似
il-15ra sushi/il-15
融合蛋白
。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白引起的
ifn
γ
增加低于对缺乏抗
ctla-4
抗原结合结构域的类似
il-15ra sushi/il-15
融合蛋白所见增加的
60
％
、
低于
50
％
、
低于
40
％
、
低于
30
％
、
低于
20
％
、
低于
10
％或低于5％
。
[0328]
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1
或
50:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1
或
10:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
3:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
5:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
8:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
10:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于或等于
15:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致受试者中
il-6
与
ifn
γ
的比率大于
或等于
20:1。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致
il-6
与
ifn
γ
的比率在
2:1-50:1
之间
、
在
3:1-30:1
之间
、
在
5:1-20:1
之间
、
在
3:1-10:1
之间
、
在
3:1-5:1
之间
、
在
5:1-30:1
之间
、
在
5:1-20:1
之间
、
在
5:1-10:1
之间
、
在
10:1-50:1
之间或在
10:1-20:1
之间
。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致
il-6
与
ifn
γ
的比率在
3:1-30:1
之间
。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致
il-6
与
ifn
γ
的比率在
3:1-20:1
之间
。
在一些实施方案中，给予本文所述的融合蛋白导致
il-6
与
ifn
γ
的比率在
2:1-20:1
之间
。
[0329]
试剂盒和制品
[0330]
本发明进一步提供包含本公开的重组融合蛋白或包含它的药用组合物的用于在受试者中预防
、
治疗或延缓癌症的试剂盒，其中该试剂盒包含一或多剂药用组合物以及如何使用药用制剂或组合物的说明
。
[0331]
在一些实施方案中，试剂盒包含注射器
、
小瓶标签和
/
或关于如何使用药物制剂或组合物的说明
。
[0332]
在本公开试剂盒的一些实施方案中，组合物的各种组分为预测量的和
/
或预包装的和
/
或无需另外测量即可使用的等等
。
本发明还任选地包含用于进行
/
使用本发明的方法和
/
或组合物的试剂盒
。
特别是，这些试剂盒任选地包括例如适当的重组融合蛋白
(
以及任选地用于进行如上所述的组合治疗的另外试剂
)。
另外，此类试剂盒还可包含用于进行本发明治疗性和
/
或预防性治疗的适当的赋形剂
(
例如药物上可接受的赋形剂
)。
此类试剂盒任选地含有用于组装和
/
或使用本发明组合物的另外组分，包括但不限于例如稀释剂等
。
[0333]
将本文所述的组合物任选地包装为包括用于进行本发明方法或用于使用本发明组合物的所有
(
或几乎所有
)
必需组分
(
任选地包括例如用于使用本发明的方法
/
组合物的书面说明
)。
例如，试剂盒可任选地包括组分比如缓冲剂
、
试剂
、
血清蛋白
、
抗体
、
底物等
。
在预包装试剂的情况下，试剂盒任选地包括无需测量即可并入到方法中的预先测量的或预先定剂量的量，例如预先测量的流体等分试样，或者可由试剂盒的终端用户容易地重构的预先称重或预先测量的固体试剂
。
[0334]
此类试剂盒一般还包括用于进行本发明方法和
/
或使用本发明组合物的适当说明
。
在一些实施方案中，以稳定形式提供试剂盒
/
包装的组分，以便防止在延长储存期间的降解或其他损失，例如防止泄漏
。
许多稳定化工艺
/
物质被广泛用于待存储的试剂等，比如包含化学稳定剂
(
即酶抑制剂
、
杀微生物剂
/
抑菌剂
、
抗凝剂
)
等
。
[0335]
为更充分地说明本发明的优选实施方案，呈现以下实施例
。
然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围
。
实施例
[0336]
实施例1：构建抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白和表达载体
[0337]
与
il-15ra sushi
结构域和
il-15
融合的
ctla-4
抗体以及该实施例中使用的
ctla-4
抗体
il-15
融合蛋白的示意图在图
1a
中显示
。
[0338]
通过
genewiz
合成编码以下构建体的
dna
序列：
[0339]
(1)
源于伊匹单抗的抗
ctla-4
抗体重链，其具有经修饰以促进异二聚化的恒定区
(“杵臼”异二聚化对的“臼”构建体
)
，与
il-15ra sushi
结构域融合，各自被
g4s
接头分开，
seq id no:18
，对应于氨基酸序列
seq id no:16
；
[0340]
(2)
源于伊匹单抗的抗
ctla-4
抗体重链，其具有经修饰以促进异二聚化的恒定区
(“杵”构建体
)
，
seq id no:seq id no:19
，对应于氨基酸序列
seq id no:10
；和
[0341]
(3)
抗
ctla-4
抗体轻链
(
伊匹单抗
)
，
seq id no:17
，对应于氨基酸序列
seq id no:9。
[0342]
根据许可协议从
horizondiscovery(cambridge,uk)
获得表达载体
pchogun。
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白表达质粒的构建如图3所概述的进行
。
简言之，通过限制性酶
bfuai
线性化
pchogun
载体，并在通过
ncoi
和
asci
进行双限制性酶消化后纯化两个重链和轻链的基因插入片段
。
按照标准方案将线性化载体
pchogun/bfuai
和纯化的两条重链和轻链的基因插入片段各自连接，并然后将其转化到大肠杆菌
dh5
α
感受态细胞中
。
将转化的
dh5
α
细胞铺板并在
37℃
下温育过夜
。
分离并通过限制性酶消化确认具有重链或轻链序列插入物的质粒
。
鉴定含有所有三种构建体的质粒构建体，并通过
dna
测序另外确认插入物
。
使用这三个质粒测序验证的质粒转染宿主细胞系
hd-biop3
，以产生用于抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白表达的生产细胞系
。
[0343]
使用与以上所述类似的策略，克隆用于伊匹单抗-il-15
融合蛋白
(
没有
il-15ra sushi
结构域，参见图
1a
，中图
)
的重链的表达载体
。
该构建体使用如上的相同轻链构建体
。
抗
ctla-4-il-15
融合蛋白的序列在以下表3中表示
。
[0344]
表
3.
抗
ctla-4-il-15
融合蛋白
[0345]
[0346][0347]
表
4.bs3
抗
ctla-4-il15-il15ra sushi
重链序列
[0348]
名称蛋白序列
dna
序列
bs3hc(
杵
)seq id no:10seq id no:19bs3hc(
臼
)seq id no:42seq id no:43
[0349]
bs3
构建体使用
seq id no:9
的轻链
。
图
1e
中的
t366w
是指
seq id no:10
的
367
位，而
y407t
是指
seq id no:42
的
408
位
。
[0350]
为评估温度稳定性，首先将样品在
1x pbs
，
ph 7.4
中稀释至
1mg/ml
，并且使用
prometheus nt.48
仪器
(nanotemper technologies inc.)
的标准方案，一式三份加载每根毛细管
10
μ
l
样品
。
使样品经受从
20℃-95℃
的
1.0℃/min
的温度梯度，并连续地监测
350nm
和
330nm
处的荧光强度
。
用
prometheus nt thermcontrol
软件
(nanotemper technologies inc.)
分析数据
。
[0351]
结果在图2中显示
。
提供来自抗
her3-神经调节蛋白-1
融合蛋白的结果用于参考
。
在图2中，抗
ctla4-il15-sushi wt
是指图
1e
右图所示的
bs3
构建体，在恒定区具有
y407t
臼和
t366w
杵突变
(
分别对应于
seq id nos:42
和
10
的
408
和
367
位
)。
抗
ctla4-il15-sushi wsav
是指包含
seq id nos:10
和
16
的重链的构建体，其中杵重链携带
s366w
取代，和臼重链携带
t366s、l368a
和
y407v
取代
(
注意这些分别对应于
seq id nos:10
和
16
中的
367、369
和
408
位
)。
将
wsav
变体用于另外的实验，因为杵-臼构建体其更稳定
。
[0352]
实施例2：与
ctla-4
相互作用的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
[0353]
ctla-4
抗体
、il-15ra sushi
结构域和
il-15
融合构建体
(
抗
ctla-4-il-15ra sushi-il-15)
与
ctla-4
相互作用并中和
ctla-4
的抑制性活性以恢复
cd28
共刺激信号传导通路
。
[0354]
通过酶联免疫吸附测定
(elisa)
来确定抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白与源于包括人类
、
食蟹猴
、
大鼠和小鼠在内的不同物种的重组
ctla-4
蛋白的结合活性
。
简言之，将
96
孔板在
4℃
下用在
pbs
中稀释的1μ
g/ml
的
ctla-4
蛋白包被过夜
。
将板在室温下用1％牛血清白蛋白
(bsa)
封闭1小时，并然后与抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
、
伊匹单抗或人类
igg1
同种型对照以从1μ
g/ml
开始的2倍连续稀释一起温育另外2小时
。
将山羊抗人
igg(fc
特异性
)-过氧化物酶抗体
(sigma
，
1:5000
稀释
)
加入到板中，并在室温下温育1小时
。
洗涤之后，将
3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺
(tmb)
底物加入到孔中以显色，并使用
multiskan
平板读数器
(thermo)
测量
450nm
处的吸光度
。
相对于抗体浓度来绘制光密度
(od450)
值
。
如图4所示，与伊匹单抗类似，抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白可结合来自人类和食蟹猴的
ctla-4
蛋白，但不结合来自大鼠或小鼠的
ctla-4
蛋白
。
[0355]
以由
genscript
开发的细胞基抗
ctla-4
生物活性测定，验证了抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白的
ctla-4
阻断活性
。
简言之，将表达
cd80
的人类细胞系
gs-c1
以
50
μ
l/
孔和1×
106细胞
/ml
的密度接种于
96
孔细胞培养板中
。
以从
2.07
μ
m(3
×
最终浓度
)
开始的2倍连续稀释，制备抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
、
伊匹单抗和人类
igg1
同种型对照，并然后将其以
50
μ
l/
孔加入到板中
。
将表达
cd28
的
t
细胞系
gs-j1
悬浮至2×
106细胞
/ml
的密度，与人类
ctla4-fc
融合蛋白
(sino biological,6mg/ml)
和
pha(sigma,15mg/ml)
混合，并然后以
50
μ
l/
孔加入到板中以开始测定
。
在
37℃
和5％
co2下温育
24
小时之后，收获每孔中的条件培养基，并按照制造商的说明
(r&d)
使用人类
il-2quantikine elisa
试剂盒测试
il-2
分泌
。
如图5所示，抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白和伊匹利单抗两者均阻断
ctla-4/cd80
相互作用并恢复
cd28
共刺激信号传导通路，从而导致
il-2
分泌
。
[0356]
实施例3：抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白保留针对表达
ctla-4
的靶细胞的抗体依赖性细胞毒性活性
[0357]
使用由
promega
开发的
adcc reporter bioassay
进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
(adcc)
活性评价
。
简言之，使用稳定地表达
fc
γ
riiia
受体和驱动萤火虫萤光素酶表达的
nfat(
激活
t
细胞的核因子
)
反应元件的设计改造的
jurkat
细胞作为效应细胞
。
当抗体与靶细胞表面上的抗原和效应细胞表面上的
fc
γ
riiia
受体结合时，发生两种细胞类型的多重交联，导致可通过由
nfat
通路激活产生的荧光素酶进行量化的
adcc moa
的通路激活
(
作用机制
)。
从
promega
获得
jurkat-nfat
细胞系，以及从
invivogen
获得
raji-hctla4
细胞系
(
靶细胞
)。
将
raji-hctla4
细胞以
25
μ
l/
孔和6×
105细胞
/ml
的密度接种于
96
孔白壁细胞培养板中
。
然后将以5倍连续稀释
(
从
1800nm
开始
)
制备的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(seq id no:9、10
和
16)
和伊匹单抗以
25
μ
l/
孔添加到板中
。jurkatnfat
细胞最终以
25
μ
l/
孔和
3x 106细胞
/ml
的密度进行接种
。
在
37℃
和5％
co2下温育
20
小时之后，使用
bio-glo
发光试剂盒
(promega)
评价抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白在促进
nfat
通路激活方面的活性
。
针对抗体浓度绘制每孔中的发光读数
。
[0358]
如图6所示，抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白和伊匹单抗两者均可诱导萤光素酶产生至类似水平
。
[0359]
实施例4：抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白与
il-2
受体的
β
亚基
(il2r
β
)
相互作用
[0360]
通过酶联免疫吸附测定
(elisa)
确定抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(seq id nos:9、10
和
16)
与
il2r
β
的结合活性
。
简言之，将
96
孔板在
4℃
下用2μ
g/ml
针对抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白的抗独特型抗体
(
克隆
31e2e3
，机构内产生
)
包被过夜，所述抗体在
pbs
中稀释
。
将板在室温下用1％
bsa
封闭1小时，并然后依序与1μ
g/ml
的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白和4倍连续稀释的人类
il2r
β
/his
标签蛋白
(
从4μ
g/ml
开始
)
一起温育
。his
标签的重组人类
il2r
β
蛋白从
acro biosystems
获得
。
将抗6×
his
过氧化物酶抗体
(sigma
，
1:5000
稀释
)
加入到板中，并在室温下温育1小时
。
洗涤之后，将
tmb
底物加入到孔中以显色，并使用
multiskan
平板读数器
(thermo)
测量
450nm
处的吸光度
。
针对
il2r
β
浓度绘制
od450
值
。
如图7所示，抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白可与
il2r
β
有效地相互作用
。
[0361]
实施例5：抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白促进
t
细胞的增殖
[0362]
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白显示出在体外促进野生型和
il15r
α
缺陷型
t
细胞两者的增殖方面的强力活性
。
[0363]
使用
celltiter-glo
发光细胞活力测定试剂盒
(promega)
评价抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
(seq id nos:9、10
和
16)
在促进
t
细胞增殖方面的活性
。
小鼠
t
细胞系
ctll-2(
野生型
)
从
atcc
获得，以及
il15r
α
缺陷型
ctll-2
细胞在机构内产生
。
将野生型
ctll-2
和
il15r
α
缺陷型
ctll-2
细胞两者以
75
μ
l/
孔和
1.33
×
106细胞
/ml
的密度接种于
96
孔白壁细胞培养板中
。
将以5倍连续稀释
(
从2μm开始
)
制备的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白
、
抗
ctla-4-il-15
融合蛋白
(
无
sushi
结构域
)
和伊匹单抗以
25
μ
l/
孔加入到板中
。
在
37℃
和5％
co2下温育
72
小时之后，根据制造商的说明评价活细胞的数量
。
通过来自空白对照孔的背景值校正每孔中的发光读数，并针对抗体浓度绘制发光读数的比率
(
测试与空白
)。
出乎意料地，如图
8a
所示，如通过发光测量的，在野生型
ctll-2
细胞上，不具有
sushi
的抗
ctla-4-il-15
融合蛋白和抗
ctla4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白两者均能够诱导荧光素酶增殖
。
此外，不具有
sushi
结构域的抗
ctla-4-il-15
融合蛋白展现出比抗
ctla4-il-15ra-sushi-il-15
更大的诱导增殖能力
。
同样出乎意料地，如图
8b
所示，当
il-15ra
被消除时
(
通过使用
il15r
α
缺陷型
ctll-2
细胞
)
，抗
ctla4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白保留诱导增殖的能力，而由不具有
sushi
结构域的抗
ctla-4-il-15
融合蛋白诱导的增殖显著地减弱
。
[0364]
使用该测定，还对具有抗
ctla-4
抗体
、il-15、il-15ra sushi
结构域和接头的不同排列的另外抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白测定了其促进
t
细胞增殖的能力
。
构建体的图解提供于图
1b-1e
中，以及序列提供于表4和表5中
。
[0365]
结果如图
9a-9d
所示
。ab-il15(
表3中的序列
)、ab-il-15su、g3、g4、g6
或
g6g3
构型中没有一种在
il15r
α
缺陷型
(ctll2-il15rako
，图
9b)t
细胞中显示出增殖
。
构建体
bs3(
表4中的序列
)
在诱导
ctll2-il15rako t
细胞增殖方面显示出比
bs2
更好的活性
(
图
9d)。
[0366]
表5：抗
ctla-4-il-15
和抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
构建体重链序列
[0367]
[0368][0369]
另外的构建体使用
seq id no:9
的轻链
。
[0370]
ab-il15
：来自图
1b
的
t366s、l368a、y407t
和
y350c
分别是指
seq id no:41
的
367、369、408
和
350
位
。l234f、s239a
和
n434a
是指
seq id no:41
的
235、240
和
435
位，例如
t366w
和
s354c
是指
seq id no:39
的
367
和
355
位
。
[0371]
ab-15il15su
：来自图
1b
的
t366s、l368a、y407t
和
y350c
分别是指
seq id no:44
的
367、369、408
和
350
位
。l234f、s239a
和
n434a
是指
seq id no:44
的
235、240
和
435
位，例如
t366w
和
s354c
是指
seq id no:39
的
367
和
355
位
。
[0372]
g2
：
ab-il15
：来自图
1c
的
t366s、l368a、y407t
和
y350c
分别是指
seq id no:48
的
367、369、408
和
350
位
。l234f、s239a
和
n434a
是指
seq id no:48
的
235、240
和
435
位，例如
t366w
和
s354c
是指
seq id no:46
的
367
和
355
位
。
[0373]
g3
：来自图
1d
的
t366w
是指
seq id no:50
的
366
位
。l234f、s239a
和
n434a
是指
seq id no:52
的
235、240
和
435
位，例如
y407t
是指
seq id no:52
的
408
位
。
[0374]
图
1c-1d
中的
g4、g6
和
g6g3
杵-臼突变类似地是指表5中提供的序列中的相应位置
。
[0375]
实施例6：抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白促进
c57bl/6
小鼠中的
nk
细胞和
cd8
+
t
细胞增殖
[0376]
将
9-11
周龄的
c57bl/6
小鼠
(gempharmatech,nanjing,china)
随机分成5组
(15
只动物
/
组
)
，并指定每一个接受以下治疗之一：
pbs(
媒介物对照
)、
抗
ctla-4-il-15
融合蛋白
(0.3mg/kg)、
抗
ctla-4-il-15
融合蛋白
(1mg/kg)、
抗
ctla-4-il-15ra-shushi-il-15(0.3mg/kg)
和抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15(1mg/kg)。
通过腹膜内注射给予小鼠单剂量治疗
。
在治疗后
3、5
和7天时，将来自每组的5只动物安乐死并使用常规程序收集新鲜血液和脾细胞
。
将每个样品用包括
pe
标记的抗小鼠
cd3(biolegend)、fitc
标记的抗小鼠
cd4(biolegend)、pe/cy7
标记的抗小鼠
cd8a(biolegend)
和
apc
标记的抗小鼠
cd335(biolegend)
的抗体混合物染色
。
通过流式细胞术分析血液和脾脏样品中的
nk
细胞和
cd8
+
t
细胞，并且将数据表示为
nk
细胞或
cd8
+
t
细胞在总细胞群中的百分比
(
平均值
±
sem
，n＝
5)。
通过单因素
anova
加配对
t
检验对与媒介物对照组相比较的治疗进行统计分析，并且如果
p《0.05
，则认为差异显著
。
[0377]
如图
10a-10c
所示，两种剂量
(0.3
和
1mg/kg)
的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
显示出在促进治疗动物的外周血和脾脏中的
nk
细胞和
cd8
+
t
细胞增殖方面的强力活性，尽管
激活反应在外周血中更为显著
。
尽管刺激
cd8
+
t
细胞的活性在具有和不具有
il-15ra sushi
结构域的抗
ctla-4il15
融合蛋白之间似乎相当，但具有
il-15ra sushi
结构域的融合蛋白在扩增
nk
细胞群方面的效力比不具有
il-15ra sushi
结构区的融合蛋白高得多
。
[0378]
与媒介物对照相比较，在接受以
0.3mg/kg
剂量治疗的动物没有明显的体重减轻
。
然而，在以
1mg/kg
剂量接受抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
或抗
ctla-4-il-15
的小鼠中观察到明显的体重减轻
。
尽管如此，在整个研究中，观察到的体重减轻
(
如果有的话
)
均低于起始体重的
10
％，表明动物对治疗良好耐受
。
[0379]
实施例7：抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白在食蟹猴中促进
t
细胞和
nk
细胞增殖
[0380]
将总共
40
只食蟹猴
(
每组5只
/
性别
)
随机指定到4组
(1-4
组
)
中，所述食蟹猴年龄为
2.5-4
岁并且每只体重为
2.5-4kg。
所有组每周给药一次，连续4周，第1组为媒介物对照组
。
第2和3组经由皮下注射
(s.c.)
分别接受
0.4
和
0.8mg/kg
的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15(seq id no:9、10
和
16)。
第4组第一剂经由皮下注射接受
1.6mg/kg
的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
，以及第二
、
第三和第四剂经由皮下注射接受
1.0mg/kg
的
jk08。
在给药前
、
第2天
、
第6天
、
第
23
天和第
27
天的时间点，将约
1.0ml
血液抽取到肝素钠抗凝剂管中进行免疫表型分型
。
[0381]
将样品储存于冰上，并在抽血后两小时内进行分析
。
[0382]
如图
11
所示，抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
诱导代表
nk
细胞群的
cd16+
细胞，
cd3+cd4+t
细胞以及
cd3+cd8+t
细胞的显著增殖
。
在指明的时间点采集外周血，然后进行
cd16、cd3、cd4、cd8
和
cd69
的标准抗体染色，然后进行
facs
分析
。
[0383]
还在图
12
中所示的时间点测定了外周血中细胞因子的水平
。
从全血样品中分离血清样品，并将其储存于
≤-65
摄氏度下直到进行分析
。
用验证的电化学发光
(msd)
方法进行分析
。
如图
12
所示，在外周血中检测到抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
对
il-6
和
il-10
以剂量依赖性方式诱导细胞因子表达
。
出乎意料地，
ifn
γ
的水平没有随着给予抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白而显著地增加
。
考虑到图
12
中所示的观察到的
il-6
水平增加，这特别令人惊讶
。
此外，
tnf
α
、il-2、il-4
和
il-8
的水平没有增加，并且保持大幅低于检测限
(
未显示
)。
[0384]
实施例8：抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
融合蛋白在表达人类
ctla-4
的小鼠中显示出抗癌活性
[0385]
使
b-hctla4
小鼠
(biocytogen,beijing,china)
在右前胁腹侧皮下注射悬浮于
0.1ml pbs
中的
mc38
结肠癌肿瘤细胞
(5
×
105细胞，
shunran shanghai biological technology co.)
进行肿瘤发育
。
当平均肿瘤大小达到
99mm3时，将荷瘤动物随机加入到7个研究组
。
每组由8只小鼠组成
。
这7组为：
g1
媒介物
、g2
伊匹单抗
(0.3mg/kg)、g3il15+sushi
结构域
igg
融合蛋白
(1mg/kg)、g4
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15(seq id nos:9、10
和
16)
低
(0.1mg/kg)、g5
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
中
(0.3mg/kg)、g6
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
高
(1mg/kg)
和
g7
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
中
(0.3mg/kg)。g1、g2
和
g7
以每周两次的频率腹膜内
(i.p.)
给予荷瘤小鼠，总共给予8次，以及
g3-g6
以每周一次的频率腹膜内给予荷瘤小鼠，总共给予4次
。
所有给予均在
pbs
中稀释，以便以适当的给予体积达到期望的剂量水平
。
每周两次测量和记录肿瘤体积和体重
。
研究在第一次给药后
36
天终止
。
在
该实验结束时，从安乐死的动物取出肿瘤，对其称重并拍照
。
[0386]
使
b-hctla4
小鼠
(biocytogen,beijing,china)
在右前胁腹侧皮下注射悬浮于
0.1ml pbs
中的
b16f10
肺癌肿瘤细胞
(1
×
105)(atcc)
进行肿瘤发育
。
当平均肿瘤大小达到
99mm3时，将荷瘤动物随机加入到7个研究组
。
每组由8只小鼠组成
。
这7组为
g1
媒介物
、g2
伊匹单抗
(5.0mg/kg)、g3 il15+sushi
结构域
igg
融合蛋白
(1mg/kg)、g4
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15(seq id nos:9、10
和
16)
低
(0.1mg/kg)、g5
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
中
(0.3mg/kg)、g6
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
高
(1mg/kg)
和
g7
抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
中
(0.3mg/kg)。g1、g2
和
g7
以每周两次的频率腹膜内给予荷瘤小鼠，总共给予6次，以及
g3-g6
以每周一次的频率腹膜内给予荷瘤小鼠，总共给予3次
。
所有给予均在
pbs
中稀释，以便以适当的给予体积达到期望的剂量水平
。
每周两次测量和记录肿瘤体积和体重
。
研究在第一次给药后
18
天终止
。
在该实验结束时，从安乐死的动物取出肿瘤，对其称重并拍照
。
[0387]
结果显示在图
13a(mc38)
和
13b(b16f10)
中
。
如图
13a
所示，给予
1mg/kg il
的抗
ctla-4-il-15ra-sushi-il-15
显著减少
mc38
小鼠
(
图
13a)
和
b16f10
小鼠
(
图
13b)
的肿瘤体积和肿瘤重量
。