结合CD71的纤连蛋白III型结构域的制作方法

本发明实施方案涉及特异性结合分化簇71(cd71)的纤连蛋白iii型结构域(fn3)以及制备和使用所述分子的方法。

背景技术：

1、cd71(也称为转铁蛋白受体1)是跨膜的，其对于细胞中的铁转运至关重要。其在许多肿瘤类型上和血脑屏障处高度表达，并且由此已成为药物递送的重要靶标。在结合至载铁转铁蛋白后，cd71被快速内吞并有效地再循环回到细胞表面。使用cd71抗体药物缀合物的研究表明，靶向cd71可改进药物递送的特异性和选择性并拓宽治疗指数。另外，使用抗cd71单克隆抗体的研究指示，结合亲和力可在实现组织特异性递送(包括平滑肌或骨骼肌递送)和血脑屏障胞吞转运中发挥重要作用。对cd71具有高亲和力的抗体可快速内化并改变正常受体输送，使得受体靶向溶酶体以供降解而非发生再循环。与之相比，对cd71具有低亲和力的抗体容许受体再循环并具有较高脑暴露。

2、在期望对目标分子具有高亲和力和特异性时，尽管抗体或抗体片段是最广泛使用的治疗蛋白种类，但非抗体蛋白也可经工程化以结合此类靶标。这些“替代架构”蛋白优于传统抗体，这是因为其尺寸小，缺少二硫化键，稳定性高，能够表达于原核宿主中，易于纯化，并且它们易于缀合至药物/毒素、可有效渗透至组织中并易于格式化成多特异性结合剂。

3、一种此类替代架构是免疫球蛋白(ig)折叠。这种折叠存在于抗体可变区以及数千种非抗体蛋白中。已证实，一种此类ig蛋白是来自人类纤连蛋白的第十纤连蛋白iii型(fn3)重复，其可耐受表面暴露环中的众多突变并且同时保留整体ig折叠结构。因此，需要可特异性结合至cd71的fn3结构域；以及使得能够经由受体介导的cd71内化进入细胞内的使用此类分子进行新颖治疗的方法。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，提供了特异性结合cd71蛋白的fn3结构域(例如多肽)。在一些实施方案中，所述fn3结构域是经分离的。在一些实施方案中，所述fn3结构域是重组的。在一些实施方案中，所述fn3结构域是非天然存在的。

2、在一些实施方案中，提供了包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，292-299或304-306，或304-306的氨基酸序列的fn3结构域。在一些实施方案中，所述fn3结构域结合至cd71。在一些实施方案中，所述fn3结构域在人类cd71上不与转铁蛋白竞争结合至cd71的位点处结合至cd71。在一些实施方案中，所述fn3结构域特异性结合至cd71。在一些实施方案中，提供了包含多于一个由接头(例如柔性接头)连结的fn3结构域的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含2、3或4个fn3结构域，所述fn3结构域由结构域之间的一个或多个接头彼此连结。

3、在一些实施方案中，提供了编码本文所阐述的fn3结构域的经分离多核苷酸。

4、在一些实施方案中，提供了包含本文所阐述的多核苷酸的载体。

5、在一些实施方案中，提供了包含本文所阐述的载体的宿主细胞。

6、在一些实施方案中，提供了产生fn3结构域的方法。在一些实施方案中，所述方法包括培养包含编码或表达fn3结构域的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化fn3结构域。在一些实施方案中，所述fn3结构域特异性结合cd71。

7、在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含结合至cd71的fn3结构域和药学上可接受的载剂。

8、在一些实施方案中，提供了结合fn3结构域(其结合至cd71)的抗独特型抗体。

9、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个fn3结构域的试剂盒。

10、在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达cd71的癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得所述肿瘤组织样品，以及通过使所述肿瘤组织样品与fn3结构域接触并检测cd71蛋白与所述fn3结构域之间的结合来检测cd71蛋白是否在所述肿瘤组织中表达，所述fn3结构域结合包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的cd71蛋白。

11、在一些实施方案中，提供了分离表达cd71的细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得样品；使所述样品与fn3结构域接触，所述fn3结构域结合包含seqid no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的cd71蛋白；以及分离结合至所述fn3结构域的细胞。

12、在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达cd71的癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使fn3结构域缀合至可检测标记以形成缀合物，所述fn3结构域结合包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的cd71蛋白；将所述缀合物施用于受试者；以及使所述缀合物所结合的表达cd71的癌细胞可视化。

13、在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

14、在一些实施方案中，结合至cd71的多肽是针对中枢神经系统。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的神经疾患和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述脑肿瘤选自由以下组成的组：非恶性脑肿瘤、良性脑肿瘤和恶性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述神经疾患选自由以下组成的组：阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease)、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病(parkinson's disease)、拉弗拉病(laforadisease)、庞贝病(pompe disease)、成人葡聚糖体病、中风、脊髓损伤、共济失调、贝尔氏麻痹(bell's palsy)、脑动脉瘤、癫痫、抽搐、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、多发性硬化、肌营养不良、神经皮肤综合征、偏头痛、脑炎、败血病和重症肌无力。

15、在一些实施方案中，结合至cd71的多肽是针对肌细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

16、在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的庞贝病(gsd2，酸性α-葡糖苷酶(gaa)缺乏)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。

17、在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的糖原贮积病的方法，所述方法包括施用本文所提供的组合物。在一些实施方案中，所述糖原贮积病选自由以下组成的组：科里病(cori's disease)或福布斯病(forbes'disease)(gsd3，糖原脱分支酶(agl)缺乏)、麦卡德尔病(mcardledisease)(gsd5，肌糖原磷酸化酶(pygm)缺乏)、ii型糖尿病/糖尿病性肾病变、醛醇缩酶a缺乏gsd12、拉弗拉病、低氧症、安德森病(andersen disease)(gsd4，糖原脱分支酶(gbe1)缺乏)、塔瑞病(tarui's disease)(gsd7，肌磷酸果糖激酶(pfkm)缺乏)和成人葡聚糖体病。在一些实施方案中，所述糖原贮积病选自由以下组成的组：糖原合酶(gys2)缺乏(gsd0)、葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc/slc37a4)缺乏(gsd1，冯吉尔克病(vongierke's disease))、赫尔斯氏病(hers'disease)(gsd6，肝糖原磷酸化酶(pygl)或肌磷酸甘油酸变位酶(pgam2)缺乏)、磷酸化酶激酶(phka2/phkb/phkg2/phka1)缺乏(gsd9)、磷酸甘油酸变位酶(pgam2)缺乏(gsd10)、肌乳酸脱氢酶(ldha)缺乏(gsd11)、范可尼-比克尔综合征(fanconi-bickel syndrome)(gsd 11，葡萄糖转运蛋白(glut2)缺乏)、醛醇缩酶a缺乏(gsd 12)、β-烯醇酶(eno3)缺乏(gsd13)和肝糖核心蛋白-1(gyg1)缺乏(gsd15)。

18、在一些实施方案中，所述结合至cd71的多肽是针对免疫细胞。在一些实施方案中，所述结合至cd71的多肽是针对树突状细胞、t细胞、nk细胞或b细胞。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的自身免疫疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述自身免疫疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、桥本氏自身免疫甲状腺炎(hashimoto's autoimmune thyroiditis)、乳糜泻、1型糖尿病、白癜风、风湿热、恶性贫血/萎缩性胃炎、斑秃和免疫性血小板减少性紫癜。

19、在一些实施方案中，提供将目标剂递送至cd71阳性细胞中的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与偶联至结合至cd71的fn3结构域(例如如本文所提供的多肽)的目标剂接触。在一些实施方案中，所述目标剂是化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、sirna分子、反义分子、rna分子、dna分子、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。

20、在一些实施方案中，本文所提供的fn3结构域缀合至多核苷酸、sirna分子、反义分子、rna分子或dna分子。

21、在一些实施方案中，所述多肽是在不与转铁蛋白竞争结合至cd71或抑制转铁蛋白结合至cd71的位点处结合至cd71的fn3蛋白。

22、在一些实施方案中，提供了鉴定在不与转铁蛋白竞争结合至cd71或抑制转铁蛋白结合至cd71的位点处结合至cd71的fn3蛋白的方法。