遗传修饰的NK细胞及其用途的制作方法

本公开涉及基因工程改造和免疫治疗领域。本公开尤其涉及经遗传修饰的nk细胞及其在疾病治疗中的用途，例如在用于癌症的car-nk疗法和/或过继细胞疗法中的用途。

背景技术：

1、自然杀伤(nk)细胞占人外周血单核细胞(pbmc)的15％，是在抵御肿瘤和病毒感染中发挥着重要作用的细胞毒性淋巴细胞，目前已知其是连接适应性免疫系统和先天免疫系统的重要组成部分。

2、nk细胞的活性受到一系列识别靶细胞或抗原呈递细胞上相应配体的共刺激(例如nkg2d、cd226)和共抑制表面受体(例如pd-1、tigit、cd96、tim-3、lag-3、nkg2a)的调节。共刺激和共抑制信号的整合决定了nk细胞的反应性。

3、tigit(具有免疫球蛋白和itim结构域的t细胞免疫受体)是nk和t细胞表达的跨膜糖蛋白受体，其是抑制t细胞和nk细胞活化的免疫检查点分子。tigit包含igv结构域、跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。cd96是同一免疫球蛋白超家族的成员，其具有相似的抑制作用，但与tigit相比，其与配体cd155的结合亲和力较低。cd155(主要)和cd112作为tigit和cd96结合的配体，从而抑制t细胞和nk细胞介导的免疫。cd155(脊髓灰质炎病毒进入受体，pvr)在正常人体组织中几乎不表达，但在各种肿瘤细胞系和原发性恶性肿瘤中高表达。临床前和临床证据已经证明，用单克隆抗体阻断tigit增强nk细胞和t细胞的抗肿瘤和抗病毒活性。

4、nkg2a(nk组2成员a)是nkg2家族的nk细胞受体，其与cd94形成异二聚体的ii型膜受体。nkg2a与cd94二聚化，形成与c型凝集素相关并识别hla-e的抑制性受体。这些抑制性受体与靶细胞上的mhc i配体相互作用，从而完全抑制细胞颗粒极化并防止细胞毒性颗粒释放。nkg2a在其胞质尾部含有两个itim。这些itim在连接具有itim的受体后经磷酸化，并促进酪氨酸磷酸酶的募集，例如含有sh2结构域的磷酸酶(shp)-1和shp-2。通过具有itim的受体招募shp-1似乎抑制信号转导的启动，因为其阻断nk细胞中的大多数下游信号。血液肿瘤和实体瘤的肿瘤细胞显示出hla-e表达上调。在各种癌症中，不良预后与hla-e上调有关。可将用抗体阻断cd94/nkg2a受体作为一种治疗策略。

5、cish(细胞因子诱导含sh2的蛋白)是nk细胞中关键的负性胞内免疫检查点，是胞内细胞因子信号转导抑制因子(socs)家族的成员并且是细胞因子和生长因子信号转导通路的重要调节因子。与其他成员类似，cish具有中心sh2结构域，该结构域能够与磷酸酪氨酸残基以及招募泛素转移酶系统的sox盒基序相互作用，从而引导它们进行蛋白酶体降解。il-15迅速诱导cish，而缺失cish的nk细胞对il-15更敏感，其特征在于增强增殖、细胞因子产生和对肿瘤的细胞毒性。

6、遗传修饰有望改变包括t细胞、树突状细胞和nk细胞在内的各种细胞类型的功能。许多工作已经进行，特别是针对一系列肿瘤抗原的t细胞进行遗传重定向。然而，对原代nk细胞进行遗传修饰中的困难导致该领域在一定程度上落后于t细胞。一些研究已使用细胞因子转基因(例如il-2、il-12或il-15转基因)来修饰nk细胞，从而通过直接向细胞提供必要的细胞因子来增强nk细胞功能。然而，大多数研究描述了通过嵌合受体重定向nk细胞特异性。

7、仍然十分需要在制备和使用过程中具有长期持久性并具有抗肿瘤作用增强和副作用减少的nk细胞。

技术实现思路

1、本文公开了经遗传修饰的nk细胞及其在疾病治疗中的用途，例如在癌症的过继细胞疗法中的用途。

2、在第一方面，本文公开了分离的经遗传修饰的nk细胞，其中nk细胞经修饰以削弱tigit、nkg2a和cish中一种或多种的功能性表达。根据一些实施方式，nk细胞还可包含嵌合抗原受体(car)

3、在一些实施方式中，提供了分离的经修饰的nk细胞，其中nk细胞经修饰以削弱tigit、nkg2a和cish中至少两种的功能性表达。

4、在一些实施方式中，提供了分离的经修饰的nk细胞，其中nk细胞经修饰以削弱tigit、nkg2a和cish中一种或多种的功能性表达，并且其中nk细胞还包含嵌合抗原受体(car)。

5、在第二方面，本文公开了包含本公开所述经修饰的nk细胞的细胞群或细胞培养物。

6、在第三方面，本文公开了包含本公开所述经修饰的nk细胞、细胞群或细胞培养物的产品。在一些实施方式中，产品是药物、药物组合物或试剂盒。

7、在第四方面，本文公开了用于制备本公开所述经修饰的nk细胞的方法。

8、在第五方面，本文公开了本公开所述经修饰的nk细胞、细胞群、细胞培养物在制备用于治疗疾病的产品中的用途。

9、在第六方面，本文公开了用于在有需要的对象中治疗疾病的方法，所述方法包括给予有效量的本公开所述经修饰的nk细胞、细胞群、细胞培养物或产品。

10、在第七方面，本文公开了本公开所述经修饰的nk细胞、细胞群体、细胞培养物或产品用于治疗疾病。

11、通过以下描述和所附权利要求书，本申请的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。然而，应理解，以下描述、所附权利要求书和具体实施例尽管示出了本申请的优选实施方式，但它们仅以示例性说明的方式给出。通过阅读以下内容，在所公开的发明的精神和范围内所做出的各种改变和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。

1.一种分离的经修饰的nk细胞，其中，所述nk细胞经修饰以削弱tigit、nkg2a和cish中两种或三种的功能性表达。

2.一种分离的经修饰的nk细胞，其中，所述nk细胞经修饰以削弱tigit、nkg2a和cish中一种或两种或三种的功能性表达，并且其中所述nk细胞还包含嵌合抗原受体(car)。

3.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述功能性表达通过基因敲除、基因突变、基因缺失、基因沉默或前述任意的组合减少或消除。

4.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述功能性表达使用crispr系统、talen系统、锌指核酸酶(zfn)系统、大范围核酸酶系统、sirna、反义rna、微小rna、短发夹rna或前述任意的组合减少或消除。

5.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述功能性表达使用crispr系统减少或消除，并且所用sgrna选自seq id no:1-6、seq id no:7-18和seq id no:19-24。

6.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述功能性表达的削弱使所述经修饰的nk细胞中靶基因的表达相较于不存在削弱的相应nk细胞降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。

7.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述nk细胞源自下组：脊椎动物(例如，人或啮齿动物细胞)的脐带血、外周血和/或胎盘和诱导多能干细胞(ipsc)；和/或所述nk细胞是自体同源的或同种异体的。

8.如权利要求2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述car包含：(i)抗原识别结构域、(ii)胞外铰链区、(iii)跨膜结构域和(iv)胞内细胞信号转导结构域。

9.如权利要求8所述的经修饰的nk细胞，其中，所述抗原识别结构域是靶向在所述靶细胞表达但在健康细胞不表达的抗原的抗体或其抗原结合片段，例如衍生自链接在一起形成单链可变片段(scfv)的单克隆抗体(mab)可变区的抗原识别结构域，或重链抗体重链的可变结构域(vhh)；和/或

10.如权利要求8所述的经修饰的nk细胞，其中，所述抗原识别结构域靶向选自下组的一种或多种抗原：cd19，cd20，her2，bcma，和/或egfr tshr，cd19，cd123，cd22，cd30，cd171，cs-1，cll-1，cd33，egfrviii，gd2，gd3，bcma，tnag，psma，ror1，flt3，fap，tag72，cd38，cd44v6，cea，epcam，b7h3，kit，il-13ra2，间皮素，il-11ra，psca，prss21，vegfr2，lewisy，cd24，pdgfr-β，ssea-4，cd2o，叶酸受体α，erbb2(her2/neu)，muc1，egfr，ncam，prostase，pap，elf2m，肝配蛋白b2，igf-i受体，caix，lmp2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，epha2，岩藻糖基gm1，sle，gm3，tgs5，hmwmaa，o-乙酰基-gd2，叶酸受体β，

11.如权利要求8所述的经修饰的nk细胞，其中，所述car包含cd3ζ内结构域(例如，包含氨基酸序列seq id no:39或由包含seq id no:40的核苷酸分子编码的多肽)，共刺激信号转导结构域，所述共刺激信号转导结构域选自cd27，cd28，4-1bb(cd137，例如，包含氨基酸序列seq id no:31或由包含seq id no:32的核苷酸分子编码的多肽)，ox40，cd30，cd4o，pd-1，icos，淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)，cd2，cd7，light，nkg2c，b7-h3，配体，其特异性结合cd83，cds，icam-1，gitr，baffr，hvem(lightr)，slamf7，nkp8o(klrf1)，cd16o，cd19，cd4，cd8α，cd8β，il2rβ，il2rγ，il7rα，itga4，vla1，cd49a，itga4，ia4，cd49d，itga6，vla-6，cd49f，itgad，cd11d，itgae，cd1o3，itgal，cd11a，lfa-1，itgam，cd11b，itgax，cd11c，itgb1，cd29，itgb2，cd18，lfa-1，itgb7，tnfr2，trance/rankl，dnam1(cd226)，slamf4(cd244，2b4)，cd84，cd96(tactile)，ceacam1，crtam，ly9(cd229)，cd16o(by55)，psgl1，cd100(sema4d)，cd69，slamf6(ntb-a，ly1o8)，slam(slamf1，cd1so，ipo-3)，blame(slamf8)，selplg(cd162)，ltbr，lat，gads，slp-76，pag/cbp，nkp44，nkp30，nkp46，和nkg2d。

12.如权利要求8所述的经修饰的nk细胞，其中，所述car通过载体转导至所述nk细胞，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体，pmscv-sffv)；和/或通过crispr系统转导至所述nk细胞。

13.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其中，所述经修饰的nk细胞处于细胞群、细胞培养物或产品中。

14.如权利要求1或2所述的经修饰的nk细胞，其相较于tigit、nkg2a和cish中一种或多种的功能表达未削弱的nk细胞具有下述一种或多种特征：

15.一种制备权利要求1-14中任一项所述的经修饰的nk细胞的方法，其包括以下步骤：(i)提供nk细胞；(ii)修饰所述nk细胞以削弱tigit、nkg2a和cish中一种或多种的功能性表达；(iii)任选地修饰所述nk细胞以使其包含嵌合抗原受体(car)；和(iv)任选地，扩增经修饰的细胞。

16.如权利要求15所述的方法，其中，步骤(ii)在步骤(iii)之前、同时或之后进行；和/或步骤(iv)在步骤(i)-(iii)中一个或多个之前或之后进行。

17.权利要求1-14中任一项所述的经修饰的nk细胞在制备用于治疗疾病的产品中的用途。

18.一种用于治疗有需要的对象中疾病的方法，其包括给予有效量的权利要求1-14中任一项所述的经修饰的nk细胞。

19.如权利要求1-14中任一项所述的经修饰的nk细胞用于治疗疾病。

20.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的nk细胞，其中，所述治疗是过继细胞疗法，优选car-nk过继细胞疗法。

21.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的nk细胞，其中，所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥和其他年龄相关疾病。

22.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的nk细胞，其中，所述疾病选自癌，肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤和白血病；和/或癌症，其选自血液系统，淋巴系统，消化系统，呼吸系统，生殖系统，运动系统和神经系统的癌症。

23.如权利要求17所述的用途，或权利要求18所述的方法，或权利要求19所述的用于治疗疾病的经修饰的nk细胞，其中，所述疾病选自下组：动脉粥样硬化、糖尿病、肝纤维化和骨关节炎。