用于增加酶活性和昆虫信息素的生产的改进的方法和细胞与流程

本发明涉及用于增加酶活性的方法，以及用于在细胞中生产被包含在信息素、特别是蛾信息素中的化合物的方法，所述化合物是诸如饱和的和去饱和的脂肪醇、饱和的和去饱和的脂肪酸以及饱和的和去饱和的脂肪醇乙酸酯、及其衍生物。

背景技术：

1、预期害虫综合治理(ipm)在提高作物产量、最大限度地减少环境影响和实现有机食品生产方面发挥重要作用。ipm采用替代性害虫控制方法，诸如使用信息素破坏交配、使用信息素进行大规模诱捕、有益昆虫等。

2、信息素构成一组不同的化学物质，昆虫(像其它生物一样)在各种情况下用它们与同一物种的个体进行交流，所述情况包括配偶吸引、警报、踪迹标记和聚集。与远距离配偶寻找相关的昆虫信息素已经在农业和林业应用中用于监测和控制害虫，作为杀虫剂的安全且环境友好的替代品。用于害虫控制的信息素的生物生产在价格、特异性和环境影响方面优于化学合成。

3、鳞翅目(lepidoptera)蛾的i型信息素是10至18个碳链长度的不饱和脂肪醇、醛或乙酸酯。在雄蛾触角中的受体对具有特定链长度、右立体异构体(双键的z或e确认)中特定碳处的去饱和以及末端官能团的信息素具有选择性(tupec,bucek,valterova，和pichova,2017)。几种生物合成酶会促进信息素生产，包括脂肪酰基辅酶a去饱和酶和脂肪酰基辅酶a还原酶。所述去饱和酶将双键引入脂肪酰基辅酶a中。它们被认为是从nadh接收细胞色素b5还原酶和细胞色素b5提供的电子的整合膜蛋白。所述脂肪酰基还原酶将饱和的或去饱和的脂肪酰基辅酶a转化为饱和的或去饱和的脂肪醇。这些酶也是整合膜蛋白，但被认为直接从nadph接收电子。

4、除了“经典的”单结构域膜结合的细胞色素b5还原酶(cytb5red)和细胞色素b5(cytb5)之外，另一种名为nad(p)h细胞色素b5氧化还原酶(ncb5or；也被称作细胞色素b5还原酶4或cyb5r4)的flavoheme还原酶是在动物界高度保守的。ncb5or酶与经典的cytb5red/cytb5对不同，因为ncb5or含有三个结构域：细胞色素b5-样结构域、细胞色素b5还原酶-样结构域和chord-sgt1(cs结构域)(deng，等人,2010)(参见图1)。cs结构域存在于许多不同的蛋白质中，并且被认为参与蛋白质-蛋白质相互作用(benson，等人,2019；zhu，等人,2004)。与cytb5red相比，ncb5or cytb5red-样结构域含有多个插入和缺失(benson等人,2019)。cytb5-样结构域也是如此(图2)(benson等人,2019)。与cytb5red/cytb5系统相比，ncb5or被认为具有根本不同的电子转移机制(benson等人,2019)。此外，它们具有利用nadh和nadph的非凡能力(benson等人,2019)。

5、已经主要在小鼠或人细胞系中研究了可溶性的ncb5or，其中ncb5or的敲除已经导致δ9去饱和的减少(zambo，等人,2020；larade，等人,2008)。迄今为止，据我们所知，还没有在昆虫中关于ncb5or基因或其功能的描述。

技术实现思路

1、本发明如在权利要求书中所定义。

2、本文提供了一种细胞，其表达：

3、i)第一种酶或第一组酶，所述酶能够将脂肪酰基辅酶a转化为选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯和去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物；和

4、ii)异源nad(p)h细胞色素b5氧化还原酶(ncb5or)；

5、由此当在相同条件下培养时，与表达所述第一组酶、但不表达异源ncb5or的细胞相比，所述细胞能够以更高的滴度和/或纯度生产所述化合物。

6、本文还提供了一种细胞，其表达：

7、i)第一种酶或第一组酶，所述酶能够将脂肪酰基辅酶a转化为选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯、去饱和的脂肪酰基辅酶a和去饱和的脂肪酸的化合物；和

8、ii)异源nad(p)h细胞色素b5氧化还原酶(ncb5or)；

9、由此当在相同条件下培养时，与表达所述第一组酶、但不表达异源ncb5or的细胞相比，所述细胞能够以更高的滴度和/或纯度生产所述化合物。

10、本文进一步提供了一种用于增加至少一种酶的活性的方法，所述酶选自由去饱和酶和脂肪酰基辅酶a还原酶(far)组成的组，所述方法包括以下步骤：

11、a.提供去饱和酶，所述酶能够在脂肪酰基辅酶a中引入至少一个双键，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为去饱和的脂肪酰基辅酶a；和/或

12、b.提供far，所述far能够将所述去饱和的脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为去饱和的脂肪醇，从而生产所述去饱和的脂肪醇；和

13、c.使所述去饱和酶和/或far与ncb5or接触，从而与在没有所述ncb5or存在下所述去饱和酶和/或far的活性相比，增加所述去饱和酶和/或far的活性，其中在相同条件下测量所述活性；

14、其中通过测量由所述去饱和酶和/或所述far形成的产物的浓度来测量活性的增加。

15、本文还提供了一种用于在细胞中生产选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯和去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

16、a.提供细胞并在培养基中温育所述细胞；和

17、b.在所述细胞中表达能够将脂肪酰基辅酶a转化为所述化合物的第一种酶或第一组酶，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为所述化合物；和

18、c.在所述细胞中表达ncb5or；

19、d.任选地，回收所述化合物。

20、本文进一步提供了一种用于增加在细胞中生产的选自去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯和去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物的滴度和/或纯度的方法，所述细胞能够合成一种或多种脂肪酰基辅酶a和/或能够从其环境中输入脂肪酰基辅酶a，所述方法包括以下步骤：

21、a.在所述细胞中表达能够将脂肪酰基辅酶a转化为所述化合物的第一种酶或第一组酶，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为所述化合物；和

22、b.在所述细胞中表达ncb5or，从而与在相同条件下来自不表达所述ncb5or的细胞的滴度和/或纯度相比，增加所述化合物的滴度和/或纯度；

23、c.任选地，回收所述化合物。

24、本文还提供了核酸构建体系统，其包含编码ncb5or和以下的核酸：

25、a.能够在脂肪酰基辅酶a中引入至少一个双键的去饱和酶；和/或

26、b.脂肪酰基辅酶a还原酶far，其能够将去饱和的脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为去饱和的脂肪醇。

27、本文进一步提供了一种部件试剂盒，其包含：

28、a.在本技术中提供的细胞；

29、b.在本技术中提供的核酸系统，其中所述构建体是用于修饰细胞；

30、c.使用说明；和

31、d.任选地，要被修饰的细胞。

32、本文还提供了ncb5or在用于增加一种或多种酶的活性的方法中的用途。

33、本文进一步提供了通过本技术的方法可得到的去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯、饱和的脂肪醇乙酸酯、去饱和的脂肪醛、去饱和的脂肪酸和/或饱和的脂肪醛。

34、本文还提供了通过本技术的方法可得到的去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯、饱和的脂肪醇乙酸酯、去饱和的脂肪醛、去饱和的脂肪酸和/或饱和的脂肪醛的用途。

35、本文进一步提供了一种监测害虫的存在或破坏害虫的交配的方法，所述方法包括以下步骤：

36、a.根据本技术的方法生产去饱和的脂肪醇和任选的去饱和的脂肪醇乙酸酯和/或去饱和的脂肪醛；和

37、b.将所述脂肪醇和任选的所述脂肪醇乙酸酯和/或所述去饱和的脂肪醛配制为信息素组合物；和

38、c.采用所述信息素组合物作为害虫综合治理组合物。

39、本文还提供了一种发酵液，其含有根据本技术的酵母细胞。

40、本文进一步提供了一种发酵系统或催化系统，其包含根据本技术的酵母细胞。

41、本文还提供了一种用于扩散信息素组合物的装置，诸如信息素分配器，所述信息素组合物包含通过本技术的方法可得到的去饱和的脂肪醇和/或去饱和的脂肪醇乙酸酯和/或去饱和的脂肪醛。

42、本文进一步提供了一种用于在细胞中生产至少1mg/l的去饱和的脂肪醇、饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪醇乙酸酯、饱和的脂肪醇乙酸酯、去饱和的脂肪醛和/或饱和的脂肪醛的方法，诸如至少1.5mg/l，诸如至少5mg/l，诸如至少10mg/l，诸如至少25mg/l，诸如至少50mg/l，诸如至少100mg/l，诸如至少250mg/l，诸如至少500mg/l，诸如至少750mg/l，诸如至少1g/l，诸如至少2g/l，诸如至少3g/l，诸如至少4g/l，诸如至少5g/l，诸如至少6g/l，诸如至少7g/l，诸如至少8g/l，诸如至少9g/l，诸如至少10g/l，诸如至少11g/l，诸如至少12g/l，诸如至少13g/l，诸如至少14g/l，诸如至少15g/l，诸如至少16g/l，诸如至少17g/l，诸如至少18g/l，诸如至少19g/l，诸如至少20g/l，诸如至少25g/l，诸如至少30g/l，诸如至少35g/l，诸如至少40g/l，诸如至少45g/l，诸如至少50g/l，或更多。

43、本文还提供了一种用于增加在细胞中生产的选自去饱和的脂肪醇、去饱和的脂肪酸以及去饱和的脂肪酰基辅酶a的化合物的纯度的方法，所述细胞能够合成一种或多种脂肪酰基辅酶a和/或能够从其环境中输入脂肪酰基辅酶a，所述方法包括以下步骤：

44、a.在所述细胞中表达能够将脂肪酰基辅酶a转化为所述化合物的第一种酶或第一组酶，从而将所述脂肪酰基辅酶a的至少一部分转化为所述化合物；和

45、b.在所述细胞中表达ncb5or，从而与在相同条件下来自不表达所述ncb5or的细胞生产相比增加所述化合物的生产；

46、其中所述化合物的纯度是所述化合物相对于所述细胞生产的相同化合物组内的所有化合物的比率或百分比，诸如所述去饱和的脂肪醇相对于所述细胞生产的所有去饱和的脂肪醇的百分比，诸如去饱和的脂肪酸相对于所述细胞生产的所有脂肪酸的百分比，和/或诸如去饱和的脂肪酰基辅酶a相对于所述细胞生产的所有脂肪酰基辅酶a的百分比。