用于控制昆虫的组合物和方法与流程

本发明涉及杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子，以及用于控制作物植物的农业相关有害生物的组合物和方法。

背景技术：

1、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)是一种革兰氏阳性的孢子形成的土壤细菌，其特征在于它产生晶体包含体的能力，这些晶体包含体对于某些目和种的植物有害生物(包括昆虫)是特异地有毒性的，但是对于植物和其他非目标生物体是无害的。出于此原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物可以用作环境上可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫有害生物或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

2、来自bt的晶体(cry)蛋白主要针对鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的有害昆虫具有潜在的杀昆虫活性。这些蛋白质还显示出针对膜翅目、同翅目、毛虱目、食毛目和壁虱目以及其他无脊椎动物目例如线形动物门(nemathelminthe)、扁形动物门(platyhelminthe)和肉鞭动物亚门(sarcomastigorphora)中的有害生物的活性(feitelson,j.1993.thebacillus thuringiensis family tree[苏云金芽孢杆菌家族树].在：advancedengineered pesticides[前沿的工程化杀有害生物剂]中.marcel dekker,inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,纽约州)。

3、术语“cry毒素”以及“δ-内毒素”与术语“cry蛋白”已可互换地使用。对于cry蛋白和基因的当前新命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性(crickmore等人(1998)microbiol.mol.biol.rev.[微生物分子生物学评论]62:807-813)。在这个更可接受的分类中，每种毒素被指定唯一的名称，该名称合并了初级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)、以及四级等级(另一个阿拉伯数字)。

4、cry蛋白是在bt的孢子形成阶段期间以晶体形式积聚为原毒素的球状蛋白质分子。不希望受理论的束缚，认为在被有害生物摄入之后，晶体典型地被溶解以释放原毒素，并且释放的原毒素被昆虫肠道中的蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加工，以产生抗蛋白酶的核心cry蛋白毒素。这种蛋白水解加工涉及从各种cry原毒素的不同区域去除氨基酸。

5、cry蛋白的毒素部分通常具有5个保守序列区块，以及三个保守结构性结构域(参见例如，demaagd等人,(2001),trends genetics[遗传学趋势],17:193-199)。第一保守结构性结构域(称作结构域i)典型地由七个α螺旋组成并且参与膜插入以及孔形成。结构域ii典型地由三个布置为希腊钥匙构型的β片层组成，并且结构域iii典型地由两个处于“果冻卷”(“jelly-roll”)构造的反平行的β片层组成(demaagd等人,2001,同上)。结构域ii和iii参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定物。蛋白质的羧基端(c-末端)部分(称为原毒素区段)可使晶体形成稳定化。

6、对任何两种或更多种彼此不同的毒素的原毒素区段和毒素结构域i、ii和iii的仔细选择和重组，有助于发现与其亲本分子具有不同特异性的有效杀昆虫嵌合蛋白。本领域已知的是，这种重组通常导致如下蛋白质的构建，这些蛋白质表现出晶体形成缺陷，或者完全缺乏针对靶标昆虫物种的可检测的杀昆虫活性。这是产生杀昆虫嵌合蛋白所需的蛋白质结构、寡聚化和活化的复杂性质的结果。

7、众多商业上有价值的植物(包括普通的农作物)易受植物有害生物(包括昆虫和线虫有害生物)的攻击的影响，导致作物产量和品质的实质性降低。例如，植物有害生物是导致全世界重要农作物损失的主要因素。昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商，以及对于家庭花匠也是负担。

8、昆虫有害生物主要是通过密集施用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫成长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素(如cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌菌株，也已经施用于作物植物中，产生了令人满意的结果，从而提供了化学杀有害生物剂的替代物或补充物。已经分离了编码这些cry蛋白中的一些的基因并且它们在异源宿主(如转基因植物)中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的手段。

9、因此可以实现良好的昆虫控制，但是某些生物制剂具有非常窄的活性谱，并且某些生物控制方法的持续使用增加了昆虫有害生物对这样的控制措施产生抗性的机会。这已经通过多种抗性管理实践(例如庇护所)得到部分缓解，但是仍然需要开发新的且有效的使用杀昆虫控制剂来控制昆虫有害生物的方法，这些杀昆虫控制剂可以靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物和/或具有与现有杀昆虫蛋白不同的作用模式。提供独特的作用模式应能有效地控制对现有产品具有抗性或可变得有抗性的昆虫有害生物。此外，这些控制方法需要为农民提供经济利益，并最大程度减少对环境的负担。

技术实现思路

1、本披露提供了针对至少鳞翅目有害生物，例如针对秋黏虫(fall armyworm)(faw，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))具有杀昆虫性的多肽，以及这样的多肽和相关核酸在组合物和方法中的用途，如在植物中或在控制鳞翅目有害生物的方法中的用途。

2、因此，在一些方面，本披露提供了嵌合cry蛋白，其中c-末端原毒素尾部的一部分不存在，并且其中该蛋白质包含与seq id no:1具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列或者包含seq id no:1。在一些实施例中，嵌合蛋白的长度不超过1100个氨基酸、1050个氨基酸、1025个氨基酸、1000个氨基酸、990个氨基酸、980个氨基酸、970个氨基酸、960个氨基酸、959个氨基酸、958个氨基酸、957个氨基酸、956个氨基酸、955个氨基酸、954个氨基酸、953个氨基酸、952个氨基酸、951个氨基酸、950个氨基酸、925个氨基酸、900个氨基酸、890个氨基酸、880个氨基酸、870个氨基酸、860个氨基酸、859个氨基酸、858个氨基酸、857个氨基酸、856个氨基酸、855个氨基酸、850个氨基酸、840个氨基酸、825个氨基酸、800个氨基酸、775个氨基酸、750个氨基酸、725个氨基酸、700个氨基酸、699个氨基酸、698个氨基酸、697个氨基酸、696个氨基酸、695个氨基酸、694个氨基酸、693个氨基酸、692个氨基酸、691个氨基酸、690个氨基酸、680个氨基酸、670个氨基酸、660个氨基酸、650个氨基酸、625个氨基酸或600个氨基酸。在一些实施例中，嵌合蛋白与seq id no:1、seq id no:2、seq idno:3或seq id no:4具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性或包含seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4。在一些实施例中，嵌合蛋白的长度不超过1100个氨基酸、1050个氨基酸、1025个氨基酸、1000个氨基酸、990个氨基酸、980个氨基酸、970个氨基酸、960个氨基酸、959个氨基酸、958个氨基酸、957个氨基酸、956个氨基酸、955个氨基酸、954个氨基酸、953个氨基酸、952个氨基酸、951个氨基酸、950个氨基酸、925个氨基酸、900个氨基酸、890个氨基酸、880个氨基酸、870个氨基酸、860个氨基酸、859个氨基酸、858个氨基酸、857个氨基酸、856个氨基酸、855个氨基酸、850个氨基酸、840个氨基酸、825个氨基酸、800个氨基酸、775个氨基酸、750个氨基酸、725个氨基酸、700个氨基酸、699个氨基酸、698个氨基酸、697个氨基酸、696个氨基酸、695个氨基酸、694个氨基酸、693个氨基酸、692个氨基酸、691个氨基酸、690个氨基酸、680个氨基酸、670个氨基酸、660个氨基酸、650个氨基酸、625个氨基酸或600个氨基酸。在一些实施例中，嵌合蛋白包含seq id no:1、2或3并且长度不超过857个氨基酸。在一些实施例中，嵌合蛋白包含seq id no:1或2并且长度不超过850个氨基酸。在一些实施例中，嵌合蛋白包含seq id no:1并且长度不超过691个氨基酸。在一些实施例中，嵌合蛋白基本上由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq idno:4组成。在一些实施例中，嵌合蛋白由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq idno:4组成。在一些实施例中，嵌合蛋白针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，嵌合蛋白针对以下中的一种或多种具有杀昆虫性：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖(pseudoplusia includens))或绒毛豆毛虫(velvet bean caterpillar)(黎豆夜蛾(anticarsia gemmatalis))。

3、本披露的其他方面涉及包含编码序列的核酸，该编码序列编码上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的嵌合蛋白。在一些实施例中，编码序列包含与seqid no:5至8中的任一个具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的核苷酸序列或包含seq id no:5至8中的任一个。在一些实施例中，编码序列进行了密码子优化用于在植物中(例如，在玉蜀黍或大豆植物中)表达。在一些实施例中，编码序列与异源启动子可操作地连接。

4、本披露的其他方面涉及载体，该载体包含上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的核酸。

5、本披露的其他方面涉及转基因宿主细胞，该转基因宿主细胞包含上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的嵌合蛋白，或上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的核酸。在一些实施例中，转基因宿主细胞是植物细胞。在一些实施例中，植物细胞是单子叶植物细胞。在一些实施例中，植物细胞是玉蜀黍细胞。在一些实施例中，植物细胞是双子叶植物细胞。在一些实施例中，植物细胞是大豆细胞。在一些实施例中，转基因宿主细胞是细菌细胞。在一些实施例中，细菌细胞是农杆菌(agrobacterium)、芽孢杆菌(bacillus)或大肠杆菌(escherichia coli)细胞。在一些实施例中，转基因宿主细胞对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

6、本披露的其他方面涉及组合物，该组合物包含上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的嵌合蛋白。在一些实施例中，该组合物进一步包含农业上可接受的运载体。在一些实施例中，组合物针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

7、本披露的其他方面涉及植物，该植物包含上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的嵌合蛋白，或上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的核酸。在一些实施例中，植物是单子叶植物。在一些实施例中，植物是玉蜀黍植物。在一些实施例中，植物是双子叶植物。在一些实施例中，植物是一种大豆植物。在一些实施例中，植物针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

8、本披露的其他方面涉及上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的植物的种子。在一些实施例中，种子针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

9、本披露的其他方面涉及从上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的植物获得的商品产品，任选地其中该商品产品是谷粒、淀粉、种子油、糖浆、面粉、粗粉、谷物或蛋白质。

10、本披露的其他方面涉及产生转基因植物的方法，该方法包括将上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的核酸引入到植物细胞中；选择包含该核酸的植物细胞；以及从选择的植物细胞再生植物。在一些实施例中，转基因植物针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

11、本披露的其他方面涉及产生转基因植物的方法，该方法包括将包含上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的核酸的第一植物与第二植物进行杂交，从而产生转基因植物。在一些实施例中，转基因植物针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

12、本披露的其他方面涉及控制鳞翅目有害生物的方法，该方法包括向有害生物递送上述实施例中任一项或本文描述的任何其他实施例所述的嵌合蛋白。在一些实施例中，嵌合蛋白通过摄食来递送。在一些实施例中，摄食包括有害生物对包含嵌合蛋白的植物部分进行摄食。在一些实施例中，鳞翅目有害生物是以下中的一种或多种：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾)。

13、本披露的其他方面涉及seq id no:1至8中任一个的序列在生物信息学分析中鉴定杀昆虫蛋白的用途(该杀昆虫蛋白例如，针对以下中的一种或多种具有杀昆虫性：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾))。

14、本披露的其他方面涉及包含seq id no:1至4中任一个的氨基酸序列的多肽在昆虫生物测定中鉴定杀昆虫蛋白的用途(该杀昆虫蛋白例如，针对以下中的一种或多种具有杀昆虫性：秋黏虫(faw，草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(sbl；大豆尺蠖)或绒毛豆毛虫(黎豆夜蛾))。

15、对序列表中的序列的简述

16、seq id no:1是截短的cry1ca v.05(在位置691处截短)的氨基酸序列

17、seq id no:2是截短的cry1ca v.06(在位置850处截短)的氨基酸序列

18、seq id no:3是截短的cry1ca v.07(在位置857处截短)的氨基酸序列

19、seq id no:4是截短的cry1ca v.08(在位置958处截短)的氨基酸序列

20、seq id no:5是截短的cry1ca v.05的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列

21、seq id no:6是截短的cry1ca v.06的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列

22、seq id no:7是截短的cry1ca v.07的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列

23、seq id no:8是截短的cry1ca v.08的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列