负荷成瘾生产菌株的制作方法

本发明提供了一种用于合成产物的微生物生产细胞，其进一步包含负荷成瘾基因线路，其表达赋予合成产物的那些细胞选择性生长和/或存活优势；同时限制非/低生产性逃逸细胞的增殖。

背景技术：

1、越来越多的世界化学品生产依赖于微生物，所述微生物被基因工程化以发挥细胞工厂的功能，并为给定分子的生物合成量身定制。采用这些细胞工厂的生产过程通常始于生产生物的少量细胞的起始培养物，其在大发酵罐(高达1000000l体积)中经历细胞数量的生长和扩增期。在一些设置中，给定分子的生产在生长期和随后的时期(分批和补料分批培养)都进行；并且可替代地，生产可以是连续的。恒化发酵罐允许生产生物在不断稀释的发酵液中生长，由此从培养物中取出产物和细胞，同时补充新鲜的营养培养基。在工业规模上，这种生产过程可以持续操作1-2个月，然后在干净的罐中开始新的培养。在此工业中使用的发酵方法和设备非常相似，既用于生产多种商品小分子，也用于生产治疗性蛋白质，因此这些方法遇到相似的问题。在其他应用中，微生物细胞可被工程化以产生非天然分子，所述非天然分子在培养细胞的环境中赋予商业优势。

2、为给定分子的生物合成分配有限代谢资源而工程化的细胞工厂承受非自然负荷；通常体现在生长较慢。这种负荷对不能合成产物分子(非生产或低生产)的细胞施加了选择压力，当生产运行持续较长时间时(例如在恒化器中)，这个问题尤其突出。工业发酵中的这种非生产细胞是非常不希望的，因为它们消耗营养、氧气和空间。由于低生产和非生产细胞生长更快，因此它们比生产细胞具有更强的选择优势。在生长的细胞培养物中，适合度的此类改善可能导致生产细胞随时间推移的显著退出竞争。从最佳生产状态的这种偏离是丢弃发酵液和将资源花费在清洁、灭菌上的最终原因，更不用说营养物，以新的生产微生物补充发酵罐。此类非生产细胞来源于经历多次生长分裂的原始生产生物的细胞中出现的基因突变。

3、由于无法避免在生产生物的细胞中发生基因突变和非基因适应，从而导致生产运行过程中细胞产物形成的下降，因此需要用于消除或减缓生产中非生产细胞生长的方法。优选地，此类消除方法足够有效，它们防止观察到的从生产状态的偏离，从而延长工业发酵的寿命。

4、本发明解决了如何剥夺细胞工厂的非生产成员的适合度优势的问题；如随时间推移延缓它们在生产性细胞工厂成员中的增殖，从而提高细胞工厂的生产率。

技术实现思路

1、本发明的第一方面提供了一种经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞，其中所述细胞进一步包含：

2、-可操作地连接到第一负荷感应启动子的第一必需基因，和

3、-可操作地连接到第二负荷感应启动子的第二必需基因，

4、其中所述第一负荷感应启动子相对于所述第一必需基因是异源的，并且所述第二负荷感应启动子相对于所述第二必需基因是异源的；其中产物的合成赋予所述细胞负荷和/或适合度代价；并且其中当所述第一负荷感应启动子被所述负荷和/或适合度代价诱导时，所述第一必需基因的表达相对于所述第一负荷感应启动子未被诱导时所述必需基因的基础水平表达被上调，并且当所述第二负荷感应启动子被所述负荷和/或适合度代价诱导时，所述第二必需基因的表达相对于所述第二负荷感应启动子未被诱导时所述第二必需基因的基础水平表达被上调。

5、本发明的第二方面提供了一种产物生物合成的方法，其包括以下步骤：

6、-提供本发明的至少一种微生物生产细胞，

7、-将所述至少一种细胞引入包含用于生产所述产物的底物的培养基中，

8、-回收所述产物。

9、本发明的第三方面提供了分别可操作地连接到第一和第二负荷感应启动子的第一和第二必需基因用于提高来源于单个细胞在至少50代后的微生物生产细胞培养群体的产物收率的用途；其中所述第一负荷感应启动子相对于所述第一必需基因是异源的，并且所述第二负荷感应启动子相对于所述第二必需基因是异源的；其中产物的生产赋予所述细胞负荷；并且其中当所述第一负荷感应启动子被所述负荷诱导时，所述第一必需基因的表达相对于所述第一负荷感应启动子未被诱导时所述第一必需基因的基础水平表达被上调，并且当所述第二负荷感应启动子被所述负荷诱导时，所述第二必需基因的表达相对于所述第二负荷感应启动子未被诱导时所述第二必需基因的基础水平表达被上调。

10、本发明的第四方面提供了本发明的微生物生产细胞用于生产生物合成产物的用途。

11、本发明的另一方面提供了一种经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞，其中所述细胞进一步包含：

12、-可操作地连接到负荷感应启动子的必需基因，

13、其中所述负荷感应启动子相对于所述必需基因是异源的；其中产物的合成赋予所述细胞负荷和/或适合度代价；其中当所述负荷感应启动子被所述负荷和/或适合度代价诱导时，所述必需基因的表达相对于所述负荷感应启动子未被诱导时所述必需基因的基础水平表达被上调；并且其中所述微生物生产细胞属于选自芽孢杆菌属(bacillus)、棒状杆菌属(corynebacterium)和曲霉属(aspergillus)的属。

技术特征：

1.一种经基因工程化以合成产物的微生物生产细胞，所述微生物细胞进一步包含：

2.根据权利要求1所述的微生物生产细胞，其中当所述细胞中的所述第一必需基因和所述第二必需基因可操作地连接到其天然启动子时，由所述产物的合成赋予的所述负荷具有适合度代价，其测量为相对于对应非生产性微生物细胞测量的所述微生物生产细胞的最大指数期生长速率的选自≥5％、≥10％、≥15％、≥20％、≥25％、≥35％和≥45％的百分比降低。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述细胞是：

4.根据权利要求1-3中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述第一必需基因和所述第二必需基因是相同的。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述第一负荷感应启动子和所述第二负荷感应启动子是不同的。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述第一必需基因和/或所述第二必需基因是非条件必需基因。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述第一必需基因和/或所述第二必需基因可操作地连接到合成rbs，所述合成rbs的序列经选择以分别独立于所述第一荷感应启动子和/或所述第二荷感应启动子的诱导来修饰所述第一必需基因和/或所述第二必需基因的翻译强度。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述第一荷感应启动子和所述第二负荷感应启动子选自：

9.根据权利要求1-8中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述细胞的特征在于，与缺乏分别可操作地连接到所述第一负荷感应启动子和所述第二负荷感应启动子的所述第一必需基因和所述第二必需基因的亲代微生物生产细胞相比，在从单个细胞进行至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100代次细胞分裂后，产物收率增加。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的微生物生产细胞，其中所述细胞的特征在于，与缺乏分别可操作地连接到所述第一负荷感应启动子和所述第二负荷感应启动子的所述第一必需基因和所述第二必需基因的亲代微生物生产细胞相比，在从单个细胞进行至少50代次细胞分裂后，产物收率增加至少10％、25％、50％或80％。

11.一种产物生物合成的方法，其包括以下步骤：

12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括分离所述产物和/或将所述产物配制成组合物，如营养组合物、药物组合物、化妆品组合物、洗涤剂组合物、润滑剂组合物或燃料组合物的步骤。

13.根据权利要求11或12所述的产物生物合成方法，其中所述产物选自：有机酸、萜类化合物、类异戊二烯、聚酮化合物、醇、糖、维生素、醛、羧酸、脂肪酸、氨基酸、肽、酶(如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、barnase、β-半乳糖苷酶、晶体蛋白、角质酶、pet酶、漆酶和碳水化合物活性酶(如木聚糖酶、地衣聚糖酶、纤维素酶、裂解多糖单氧化酶和果胶酶))、治疗性蛋白质及其前体(如人生长激素、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、单克隆抗体和多克隆抗体、单片段抗体和纳米抗体)、鸡蛋中天然存在的蛋白质(如卵清蛋白)、乳蛋白(如酪蛋白、乳凝集素、乳铁蛋白)、分泌型免疫球蛋白a和g、分泌成分。

14.分别可操作地连接到第一负荷感应启动子和第二负荷感应启动子的第一必需基因和第二必需基因用于提高来源于单个细胞的至少50代后的微生物生产细胞培养群体的产物收率的用途；

15.根据权利要求14所述的分别可操作地连接到所述第一负荷感应启动子和所述第二负荷感应启动子的所述第一必需基因和所述第二必需基因的用途，其中与缺乏分别可操作地连接到所述第一负荷感应启动子和所述第二负荷感应启动子的所述第一必需基因和所述第二必需基因的亲代微生物生产细胞相比，在从单个细胞进行至少50代次细胞分裂后，产物收率增加至少10％、25％、50％或80％。

16.根据权利要求1-10中任一项所述的微生物生产细胞用于生产生物合成产物的用途，所述生物合成产物如有机酸、萜类化合物、类异戊二烯、聚酮化合物、醇、糖、维生素、醛、羧酸、脂肪酸、氨基酸、肽、酶(如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、barnase、β-半乳糖苷酶、晶体蛋白、角质酶、pet酶、漆酶和碳水化合物活性酶(如木聚糖酶、地衣聚糖酶、纤维素酶、裂解多糖单氧化酶和果胶酶))、治疗性蛋白质及其前体(如人生长激素、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、单克隆抗体和多克隆抗体、单片段抗体)、鸡蛋中天然存在的蛋白质(如卵清蛋白)、乳蛋白(如酪蛋白、乳凝集素、乳铁蛋白)、分泌型免疫球蛋白a和g、分泌成分、纳米抗体。

技术总结
本发明提供了一种用于合成产物的微生物生产细胞，其进一步包含负荷成瘾基因线路，所述基因线路表达赋予合成所述产物的那些细胞选择性生长和/或存活优势；同时限制低生产性或非生产性逃逸细胞的增殖。

技术研发人员：P·鲁格比约,K·B·法尔肯伯格,J·库恩,C·蒙克,L·塔普·洛吉
受保护的技术使用者：恩多罗基因有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16