一种同步检测建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒和建兰环斑病毒的引物探针及其应用

本技术涉及病原体检测，尤其涉及一种同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv和建兰环斑病毒cymrsv的引物探针及其应用。

背景技术：

1、蝴蝶兰等兰科植物有重要的观赏价值和经济价值，但是近年来随着蝴蝶兰等兰科植物产品的国内外贸易和种质交流频率的增加，病毒病的发生有蔓延趋势，加速了一些种传病害如病毒病等的发生和蔓延；目前世界上已有30多种病毒可感染兰科植物，其中建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus，cymmv)和齿兰环斑病毒(odontoglossumringspotvirus，orsv)在兰花中最常见，分布最广，危害最严重，以一种或两种病毒复合侵染的占多数，和其他病毒共同侵染造成三种病毒复合侵染的现象也有发生。建兰环斑病毒(cymbidium ringspotvirus，cymrsv)也是感染较严重的病毒种类之一，目前主要在欧洲、北美洲、南美洲等地发生较严重。目前国际上对蝴蝶兰等花卉的病毒病还未有防治的有效药剂，为培养健康优质的种苗以及观赏价值高的花卉产品，需要对感染病毒病的植株进行早期发现、早期隔离处理，因此建立一套高效、灵敏，可同步检测cymmv、orsv和cymrsv的方法非常重要。

2、目前，病毒的检测方法包括指示植物法、酶联免疫吸附法、电子显微镜技术、逆转录环介导的等温扩增、rt-pcr和实时荧光定量pcr(qrt-pcr)等，其中，指示植物法可直接检查植株叶子和茎有无可见的病毒症状，虽然简单，但耗时长，最短需10～20d，长的需1～3月，灵敏度较低，受季节限制，人力物力成本高；电镜法费时，设备昂贵，且可靠结果需依据长期经验积累；elisa法周期性长，灵敏度为纳克水平，对于更低浓度的病毒含量无法检出；rt-pcr分子生物学方法理论上具特异性强，灵敏度达fg级，但在pcr过程中可能存在样品非特异性扩增而出现假阳性，且仅为定性检测；基因芯片技术操作复杂、费时，对操作人员的专业要求较高，且基因芯片制作较昂贵，极大限制了该技术的推广。实时荧光定量qrt-pcr(quantitative real-time,qrt-pcr)方法是利用荧光信号的变化实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过cq值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，与常规pcr技术比较，该方法无需电泳等步骤，实现了样品中所含的模板量的定量检测，具特异性高，重复性好，耗时短、操作简便的特点，是目前检测灵敏度最高的方法。基于taqman探针的多基因精准实时荧光定量pcr方法相比单基因qrt-pcr技术，在保证了高检测灵敏度(1～10copies)的同时，成本更为低廉，耗时更短。该技术因其快速、高效、特异性好、灵敏度高等优点，已广泛应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测、基因表达量分析等领域，具有广阔的发展应用空间。

3、cymmv、orsv和cymrsv均是rna单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，因此，利用三重实时荧光定量pcr技术检测其的难点在于保守序列的选择和引物、探针组合的设计以及检测体系的优化，试验时还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。

4、目前有关cymrsv检测方面的研究较少，特别兰花中cymmv、orsv和cymrsv三种病毒的多基因同步检测技术尚未有报道。如何提供能同步检测cymmv、orsv、cymrsv的三重实时荧光定量pcr特异性引物和探针，以及如何提供一种快速高效、稳定可靠的cymmv、orsv、cymrsv三重实时荧光定量pcr检测方法，为培养健康优质的兰花种苗，实现带毒种苗/盆花的早发现、早隔离及早预防，从而提升产品质量及企业经济效益奠定一定的基础，成为亟待解决的技术问题。。

技术实现思路

1、为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了用于对建兰花叶病毒(cymbidiummosaic virus，英文简称cymmv)、齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus，英文简称orsv)、建兰环斑病毒(cymbidium ringspot virus，英文简称cymrsv)进行实时荧光定量pcr同步检测的引物和探针及其应用，能够在大幅降低成本的同时，实现快速、高灵敏度、高特异性的定量检测，为对建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv、建兰环斑病毒cymrsv的早检测早防控提供技术支撑。

2、为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

3、本说明书实施例提供一种同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv和建兰环斑病毒cymrsv的引物探针，所述引物和探针可以包括：cymmv的上游引物cymmv-f、下游引物cymmv-f和探针cymmv-probe；orsv的上游引物orsv-f、下游引物orsv-r和探针orsv-probe；cymrsv的上游引物cymrsv-f、下游引物cymrsv-r和探针cymrsv-probe；

4、引物序列和探针序列具体如下：

5、cymmv的引物对和探针为：

6、cymmv的上游引物cymmv-f：5’-ctgatgctggccactaacga-3’；

7、cymmv的下游引物cymmv-r：5’-cacgttcacggtcagtaggg-3’；

8、cymmv的探针cymmv-probe：

9、fam-ccgccaactgggccaaggct-bhq1；

10、orsv的引物对和探针为：

11、orsv的上游引物orsv-f：5’-ttgaccagtaggttccctgc-3’；

12、orsv的下游引物orsv-r：5’-tagttgtcggattctgcggat-3’；

13、orsv的探针orsv-probe：

14、hex-tggttacttcagagtttatcgctatg-bhq1；

15、cymrsv的引物对和探针为：

16、cymrsv的上游引物cymrsv-f：5’-cgcagtgggtgacttatt-3’；

17、cymrsv的下游引物cymrsv-r：5’-cgtcgtggctgtggtag-3’；

18、cymrsv的探针cymrsv-probe：

19、cy5-cacagtaaccttctacgaaccgcaaccg-bhq3。

20、本说明书实施例提供的一种实时荧光定量pcr扩增体系，其特征在于，所述扩增体系可以包括：premix ex taq(2×)混合液12.5μl和rnase free ddh2o 3.7μl。

21、本说明书实施例提供的一种同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv和建兰环斑病毒cymrsv的引物探针在对建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv、建兰环斑病毒cymrsv进行同步检测的检测方法中的应用，所述检测方法可以采用前文所述的用于同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv和建兰环斑病毒cymrsv的引物探针，以及前文所述的实时荧光定量pcr扩增体系。

22、本说明书实施例提供的一种同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv、建兰环斑病毒cymrsv的试剂盒，所述试剂盒可以包括：前文所述的用于同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv和建兰环斑病毒cymrsv的引物探针，以及前文所述的实时荧光定量pcr扩增体系。

23、本说明书中至少一个实施例能够达到以下有益效果：

24、通过设计用于同步检测建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv、建兰环斑病毒cymrsv的多基因实时荧光定量pcr同步检测引物和探针，并将所述引物和探针应用于对建兰花叶病毒cymmv、齿兰环斑病毒orsv、建兰环斑病毒cymrsv进行同步检测的方法中，能够更快速、准确地检测出该三种病毒，用时仅为单基因实时荧光定量pcr技术的三分之一，降低检测成本，每样品检测成本约降低1/3～1/2；且特异性强，灵敏高，灵敏度可达1～10copies，可为cymmv、orsv、cymrsv的早检测、早防控提供高效可行的检测方法，对工厂化生产优质健康的蝴蝶兰等兰花种苗具有重要意义。