一种用于核酸递送的新型可电离脂质及其LNP组合物和疫苗的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种用于核酸递送的新型可电离脂质及其lnp组合物和疫苗。

背景技术：

1、目前递送mrna在临床上经过验证的系统为脂质纳米粒(lipid nanoparticle，lnp)，属于脂质形成的纳米微粒，其中原理包括阳离子脂质，而现有技术研究表明，mrna递送至细胞内后，mrna表达率偏低，例如dlin-mc3-dma作为阳离子脂质构建lnp，mrna的表达量为0.63％(maugeri,marco et al.“linkage between endosomal escape of lnp-mrnaand loading into evs for transport to other cells.”nature communications，2019)，因此，阳离子脂质的结构是影响mrna表达量的关键因素。

2、流感疫苗是用来预防流行性感冒病毒引起的流行性感冒(简称流感)的疫苗，适用于任何可能感染流感病毒的健康人，每年在流行季节前接种一次，免疫力可持续一年。

3、流感疫苗是预防和控制流感的主要措施之一。接种流感疫苗可以减少接种者感染流感的机会或者减轻流感症状。

4、2018年2月22日世界卫生组织发布的2018-2019年度北半球季节性流感疫苗推荐组分，四价流感病毒裂解疫苗包含甲型h1n1、甲型h3n2、乙型yamagata系(by)、乙型victoria系(bv)四种流感病毒抗原成分，三价流感病毒裂解疫苗包含甲型h1n1、甲型h3n2、乙型victoria系(bv)三种流感病毒抗原成分，不包括乙型yamagata系(by)流感病毒抗原成分。四价流感病毒裂解疫苗包含上述两种甲型和两种乙型共四种流感病毒抗原成分，可涵盖更多的流感流行型别，将有效预防和控制流感疫情。

5、目前已上市的流感疫苗主要为全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，尚无mrna疫苗。

技术实现思路

1、本发明术语“中性脂质”术语是指不带电荷的、非磷酸甘油酯的脂质分子。

2、本发明术语“聚乙二醇(peg)-脂质缀合物”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。

3、本发明术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少一个纳米量级尺寸的颗粒，其包含至少一种脂质。

4、本发明术语“疫苗”是指适合于应用于动物(包括人)的组合物，在施用后诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助预防、改善或治愈起因于由微生物感染的临床疾病。

5、本发明术语“递送系统”是指调控生物活性成分在空间、时间及剂量在生物体内分布的制剂或组合物。

6、本发明术语，n/p为阳离子脂质中n与mrna单核苷酸中p的摩尔比。

7、本发明术语“烃基”是指相应的烃失去一个氢原子后剩余的基团，在本发明中特别指脂烃基，例如烷基、烯基、炔基，特别是烷基。

8、本发明涉及一种阳离子脂质，具有如下式i结构：

9、

10、其中：

11、l1和l2至少一个为-o-、-o(c＝o)o-、-(c＝o)nra-、-nra(c＝o)-或-nra-，

12、并且，

13、l1或l2中的另一个为-o-、-o(c＝o)o-、-(c＝o)nra-、-nra(c＝o)-、-nra-、-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-s(o)x-、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-；

14、g1和g2各自独立地为未取代的c1-c12亚烷基或c1-c12亚烯基；

15、g3为c1-c24亚烷基、c1-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；

16、ra为h或c1-c12烃基；

17、r1和r2各自独立地为c6-c24烷基或c6-c24烯基；

18、r3为h、oh、or4、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或–nr5c(＝o)r4；

19、r4为c1-c12烃基；

20、r5为h或c1-c6烃基；

21、x为0、1或2。

22、具体地，其中的阳离子脂质式i结构中l1和l2各自独立地选自-o-、-o(c＝o)o-、-(c＝o)nh-、-nh(c＝o)-和-nh-。

23、具体地，其中的阳离子脂质式i结构中，l1和l2均为-o-，或者，l1和l2均为-o(c＝o)o-，或者，l1和l2均为-nh-，或者，l1为-nh(c＝o)-，l2为-(c＝o)nh-。

24、具体地，其中的阳离子脂质其有以下结构(ia)：

25、

26、其中：

27、r6在每次出现时独立地为h、oh或c1-c24烃基；

28、n为1至15的整数。

29、具体地，其中的阳离子脂质其有以下结构(ib)：

30、

31、其中y和z各自独立地为1至12的整数。

32、具体地，其中的阳离子脂质结构中n为2至12的整数，优选的，n为2、3、4、5或6；其中y和z各自独立地为2至10的整数，优选的，为4至9的整数。

33、具体地，其中的阳离子脂质结构中r1和r2各自独立地具有以下结构：

34、

35、其中：

36、r7a和r7b在每次出现时独立地为h或c1-c12烃基；并且a为2至12的整数，优选的，a为8至12的整数；

37、其中r7a、r7b和a各自被选择为使得r1和r2各自独立地包含6至20个碳原子。

38、具体地，其中的阳离子脂质结构中至少一次出现的r7a为h，优选的，r7a在每次出现时为h。

39、具体地，其中的阳离子脂质结构中至少一次出现的r7b为c1-c8烃基；优选的，其中c1-c8烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

40、具体地，其中的阳离子脂质结构中r1或r2或两者具有以下结构之一：

41、

42、

43、具体地，其中的阳离子脂质化合物下结构如下：

44、

45、

46、

47、本发明涉及一种脂质纳米颗粒，包含：(a)阳离子脂质；(b)非-阳离子脂质；(c)聚乙二醇(peg)-脂质缀合物。优选地，包含：阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质和/或聚乙二醇(peg)-脂质缀合物。

48、具体地，其中的聚乙二醇(peg)-脂质缀合物选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四烷基乙酰胺(alc-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(peg-dmg)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](peg-dspe)、peg-二甾醇基甘油

49、(peg-dsg)、peg-二棕榈油基、peg-二油基、peg-二硬脂基、peg-二酰基甘油酰胺(peg-dag)、peg-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dppe)、peg-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(peg-c-dma)或dmg-peg2000中的一种或多种组合，优选的为dmg-peg2000。

50、具体地，其中的中性脂质选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dopg)、油酰磷脂酰胆碱(popc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)中的一种或多种组合，优选的为dspc。

51、具体地，其中的甾族脂质选自燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇以及经多肽修饰后的胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或多种组合，优选的为胆固醇。

52、具体地，其中的阳离子脂质摩尔含量为20～60％、中性磷脂摩尔含量约为5％～25％、甾族脂质摩尔含量约为25％～55％；聚乙二醇(peg)-脂质缀合物摩尔含量约为0.5％～15％，

53、具体地，其中阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(peg)-脂质缀合物摩尔比为30-60:1-20:20-50:0.1-10，优选的，其中阳离子脂质：中性磷脂：甾族脂质：聚乙二醇(peg)-脂质缀合物摩尔比为47:10:41.5:1.5或44:10:44:2。

54、具体地，所述疫苗中还包含其他辅料，其中辅料为醋酸钠、氨丁三醇、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠、蔗糖中的一种或多种组合。

55、具体地，其中纳米颗粒的平均粒径为50～200nm或其中纳米颗粒在中性ph下具有净中性电荷或其中纳米颗粒具有小于0.4的多分散性。

56、本发明涉及一种脂质纳米颗粒mrna疫苗的制备方法。具体地，将阳离子脂质、非-阳离子脂质、聚乙二醇(peg)-脂质缀合物溶解至溶剂后与mrna混合后制得。

57、具体地，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(peg)-脂质缀合物溶解至乙醇后与经稀释后的mrna稀释液混合后经超滤、稀释、过滤后制得；优选的，将阳离子脂质、中性磷脂、甾族脂质、聚乙二醇(peg)-脂质缀合物溶解至乙醇后与经稀释后的mrna稀释液按一定流速比混合后经超滤、稀释、过滤后制得；优选的，其中的超滤方式为切向流过滤；更优选的，其中的混合方式可为湍流混合、层流混合或微流体混合。

58、具体地，稀释液可为乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。

59、具体地，其中缓冲液ph为3～6，浓度为6.25～200mm。

60、具体地，将阳离子脂质、非-阳离子脂质、聚乙二醇(peg)-脂质缀合物溶解至溶剂后所得的脂质混合溶液与mrna稀释后的溶液流速比为1～5:1。

61、具体地，脂质包封mrna时的n/p为2-10，优选的n/p为3-9，更优选的，n/p为3、4、5、6、7、8、9。

62、具体地，其中的超滤液选自由以下组成的组：钠盐和三(羟甲基)氨基甲烷(tris)盐，优选的，超滤液ph为6.5～8.5。

63、本发明提供一种流感病毒脂质纳米颗粒mrna疫苗，具体地，给药方式可为口服、肌肉注射、静脉注射或吸入。

64、具体地，流感病毒脂质纳米颗粒mrna疫苗的剂型可为口服制剂、液体制剂、冻干粉剂、注射剂或吸入制剂，优选的，为肌肉注射剂、静脉注射剂、干粉吸入剂或雾化吸入剂。

65、本发明涉及一种流感病毒脂质纳米颗粒mrna疫苗，包含：(a)编码流感病毒ha、na、m蛋白和/或n蛋白的mrna；(b)阳离子脂质；(c)非-阳离子脂质；(d)聚乙二醇(peg)-脂质缀合物。

66、具体地，其中的流感病毒脂质纳米颗粒mrna疫苗，包含：(a)编码流感病毒ha、na、m蛋白和/或n蛋白的mrna；(b)上述阳离子脂质；(c)中性磷脂、甾族脂质；(d)聚乙二醇(peg)-脂质缀合物。

67、具体地，其中的流感病毒脂质纳米颗粒mrna疫苗，或被alc-0315制备的脂质纳米颗粒包裹。

68、所述流感疫苗编码抗原源自4种季节性流感毒株选自甲型流感病毒h1n1、h3n3、b型流感病毒的山形株(yamagata)和/或维多利亚株(victoria)中的一种或多种的。

69、具体地，其中mrna编码的氨基酸序列包含seq id no:1-8一种或多种所示序列。或者与seq id no:1-8所示序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％同一性的氨基酸序列。

70、甲型h1n1毒株的ha抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；

71、甲型h3n2毒株的ha抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；

72、乙型victoria系毒株的ha基因编码的氨基酸序列如seq id no.3所示；

73、乙型yamagata系毒株的ha基因编码的氨基酸序列如seq id no.4所示；

74、甲型h1n1毒株的na抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示；

75、甲型h3n2毒株的na基因编码的氨基酸序列如seq id no.6所示；

76、乙型yamagata系毒株的na基因编码的氨基酸序列如seq id no.7所示；

77、乙型victoria系毒株的na基因编码的氨基酸序列如seq id no.8所示。

78、本发明选择特定的阳离子脂质并与非-阳离子脂质及聚乙二醇(peg)-脂质组合制备脂质纳米颗粒，实验发现具有良好的体外稳定性以及小鼠免疫反应。

79、本发明涉及核酸-脂质纳米颗粒疫苗在制备用于预防癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染的疫苗中的应用。

80、具体地，其中的病毒感染选自流感病毒，其特征在于，其中的流感病毒可选自甲型流感病毒、b型流感病毒；优选的，其中甲型流感病毒可选自由h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17和h18组成的组的血凝素(ha)的甲型流感病毒；更优选的，其中甲型流感病毒选自由n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、n10和n11组成的组的神经氨酸酶(na)的甲型流感病毒；更优选的，甲型流感病毒选自由h1n1、h1n2、h2n2、h3n1、h3n2、h3n8、h5n1、h5n2、h5n3、h5n8、h5n9、h7n1、h7n2、h7n3、h7n4、h7n7、h7n9、h9n2、h10n8和h10n7组成的组，优选地选自h1n1、h3n2、h5n1和h5n8。

81、本发明有益效果：

82、本发明提供系列新型阳离子脂质，采用脂质纳米颗粒作为递送系统，通过构建全新的阳离子脂质具有更优的理化性质，其包封率、稳定性显著优于已上市的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒递送系统，

83、本发明提供了一种脂质纳米颗粒的流感病毒mrna疫苗，。利用该lnp载体包载的流感抗原mrna制成疫苗，通过两次免疫动物(肌肉注射)，动物体内产生了高水平的特异性体液和细胞免疫反应，实验证明了利用新型阳离子脂质制备的疫苗具有较高的免疫效力。