乙型肝炎疫苗及其生产方法与流程

本公开属于生物制药，具体涉及一种诱导乙肝表面抗原表达的方法、乙肝表面抗原纯化的方法、生产乙型肝炎疫苗的方法和乙型肝炎疫苗。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hbv)是一种dna型病毒，基因组为3.2kb的双链dna分子，可以通过血液或其它体液传播的方式进行感染。乙型肝炎病毒可以在体外存活至少7天。在此期间，如果乙型肝炎病毒侵入到没有接种疫苗的个体，该个体很可能会感染。乙型肝炎病毒的潜伏期为30到180天。

2、hbv是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化，进而引发乙型肝炎(俗称乙肝)。乙肝病毒可在感染后30至60天内被检测到，并可持续存在并发展成慢性乙型肝炎，尤其是在婴儿或儿童阶段感染，慢性乙肝可能会发展成为肝硬化甚至肝癌。

3、世界卫生组织(who)明确指出，接种乙肝疫苗是预防乙肝的主要方法，建议婴儿出生后尽早(最好是在24h内)接种乙肝疫苗。重组酵母乙型肝炎疫苗是一种乙肝表面抗原(hbsag)亚单位疫苗，采用转基因的方法将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，转入酵母中，构建重组酵母，通过培养这种重组酵母来表达乙肝表面抗原亚单位。

4、2022年5月，第75届世界卫生大会通过的《2030年可持续发展议程》中确定了全球消除肝炎的目标，因此，生产一种产量高，成本低的重组乙型肝炎疫苗是完成这个目标的重要途径。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本公开提供了一种诱导乙肝表面抗原表达的方法、乙肝表面抗原纯化的方法、生产乙型肝炎疫苗的方法和乙型肝炎疫苗。

2、第一方面，本公开提供一种诱导乙型肝炎表面抗原表达的方法，所述方法包括：

3、将表达乙肝表面抗原的酵母，按照2.0～6.0％的比例接种到第一级培养基中进行一级发酵，得到第一级培养液；

4、取第一级培养液，按照2.0～6.0％的比例接种到第二级培养基中进行二级发酵，得到第二级培养液；

5、取第二级培养液，按照1.5～3.0％的比例接种到第三级培养基中进行三级发酵，当发酵液中细菌密度生长至od600值为100～200，起始添加甲醇，诱导乙肝表面抗原表达，收获发酵产物。

6、在一些实施方案中，所述一级发酵的温度为33～35℃。

7、在一些实施方案中，所述二级发酵的温度为33～35℃，优选为33℃。

8、在一些实施方案中，所述三级发酵的温度为30～35℃，优选为33～35℃，更优选为33℃。

9、在一些实施方案中，所述od600为130～170。

10、在一些实施方案中，甲醇(诱导物)的添加方式采取连续恒流添加的方式。

11、在一些实施方案中，在诱导培养过程，甲醇的添加量随发酵液od600值以及发酵液量的增长同比例增长。

12、在一些实施方案中，在诱导培养过程中，甲醇的添加速度为1.0-2.0ml/100od600/l发酵液/小时(即若发酵液od600为100，每小时每升发酵液中连续流加1.0-2.0ml甲醇；若od600为170，每小时每升发酵液中连续流加1.7-3.4ml甲醇，即甲醇添加量随发酵液od值以及发酵液量的增长同比例增长)。

13、在一些实施方案中，在诱导期间，控制所述第三级培养基的ph为4.0～6.0。

14、在一些实施方案中，酵母选自汉逊酵母、毕赤酵母和啤酒酵母。

15、在一些实施方案中，乙肝表面抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示：

16、menitsgflgpllvlqagfflltriltipqsldswwtslnflggspvclgqnsqsptsnhsptscppicpgyrwmclrrfiiflfilllclifllvlldyqgmlpvcplipgstttstgpcktcttpaqgnsmfpsccctkptdgnctcipipsswafakylwewasvrfswlsllvpfvqwfvglsptvwlsaiwmmwywgpslysivspfipllpiffclwvyi。

17、在一些实施方案中，将hbsag基因连接到pmd19-t载体(宝生物工程有限公司)上，得到质粒phbsag，将质粒phbsag导入汉逊酵母，获得乙型肝炎汉逊酵母工程菌株。

18、第二方面，本公开提供一种乙肝表面抗原纯化的方法，所述方法包括：

19、1)将第一方面的发酵产物进行菌体破碎，离心后收集第一上清液；

20、2)在所述第一上清液中添加聚乙二醇，静置沉淀，离心，收集第二上清液；

21、3)在所述第二上清液中添加硅胶，以吸附所述第二上清液中的乙肝表面抗原，通过离心收集吸附有乙肝表面抗原的硅胶沉淀；

22、4)在所述吸附有乙肝表面抗原的硅胶沉淀中添加解吸附缓冲液，以解除硅胶对乙肝表面抗原的吸附，获得含乙肝表面抗原的第三上清液；

23、5)对所述第三上清液依次进行第一超滤、离子交换层析、第二超滤和凝胶过滤层析，得到乙肝表面抗原原液。

24、在一些实施方案中，在步骤2)中，先调节所述第一上清液的ph为5.0～8.0，再添加聚乙二醇；和/或

25、所述步骤2)中添加的聚乙二醇选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，优选为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；和/或

26、在步骤2)中，聚乙二醇的终浓度为3％～6％，优选为4％～5％。

27、在一些实施方案中，在所述步骤3)中，硅胶以气相二氧化硅的形式添加，气相二氧化硅的终浓度为0.5％～2.0％。

28、在一些实施方案中，在所述步骤3)中，所述吸附的条件为2～8℃吸附12～20h。

29、在一些实施方案中，在所述步骤4)中，解除硅胶吸附的温度为50-62℃，优选为52～62℃。

30、在一些实施方案中，所述解吸附缓冲液含有0.8-3.4g/l的脱氧胆酸钠，优选为2-3g/l。

31、在一些实施方案中，在所述步骤5)中，所述第一超滤采用截流孔径为50-1000kda的超滤膜，进一步优选为300-500kda的超滤膜。

32、在一些实施方案中，在所述步骤5)中，所述离子交换层析为阴离子交换层析。

33、在一些实施方案中，所述离子交换层析使用的层析介质选自deae sepharosefast flow、mospheretm iex-50q、mospheretm iex-50deae、gp deae-60或deae sephardexa-50，优选为mospheretm iex-50deae或deae sepharose fast flow。

34、在一些实施方案中，所述离子交换层析使用的平衡液中氯化钠的含量为0.05～0.20mol/l，优选氯化钠的含量为0.1～0.15mol/l的硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。

35、在一些实施方案中，所述平衡液中缓冲盐的浓度为10-100mm，进一步优选为10-60mm。

36、在一些实施方案中，所述离子交换层析使用的洗脱液中氯化钠的含量为0.1～0.55mol/l，优选氯化钠的含量为0.25-0.55mol/l的硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。

37、在一些实施方案中，所述洗脱液中缓冲盐的浓度为10-100mm，进一步优选为10-60mm。

38、在一些实施方案中，所述离子交换层析使用的洗脱液的ph为6.0-8.0。

39、在一些实施方案中，在所述步骤5)中，所述第二超滤采用截流孔径为50-1000kda的超滤膜，进一步优选为300-500kda的超滤膜。

40、在一些实施方案中，在所述步骤5)中，所述凝胶过滤层析使用的层析介质选自sephacryl s-300hr、sephacryl s-400hr、sephacryl s-500hr、sepharose 4fastflow、sepharose 6fastflow或sepharose 2b，优选为sephacryl s-500hr或sepharose4fastflow。

41、在一些实施方案中，所述凝胶过滤层析使用的洗脱液选自10～100mm，优选为10～60mm的硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液。

42、在一些实施方案中，所述凝胶过滤层析使用的洗脱液的ph为6.0-8.0。

43、在一些实施方案中，通过低温高压匀浆或低温冷冻球磨裂解汉逊酵母菌体提取抗原；采用分步沉降的方式对抗原提取液进行纯化，首先使用在0.3～0.6mol/l盐溶液、3％～6％peg含量的中性环境中沉降杂蛋白，离心后收集上清，随后在上清液中加入0.5％～2.0％气相二氧化硅对抗原进行吸附，收集硅胶吸附沉淀后，使用含有0.8～3.4g/l的脱氧胆酸钠溶液对沉淀进行抗原解吸附，收集离心后的上清溶液，将粗纯化后的抗原料液用截流孔径为50-1000kda的超滤膜进行超滤浓缩，超滤后的料液利用ph值为6.0～8.0的硼酸缓冲液、磷酸缓冲液或tris-hcl缓冲液进行离子交换层析纯化，得到层析液1；层析液1再进行一次超滤后利用20～100mm磷酸缓冲液(ph7.0)通过凝胶过滤层析进一步纯化后，得到精纯液。精纯液通过ph3.0～4.0的硫酸铝钾溶液进行在位吸附，即为铝吸附产物，再经疫苗稀释液稀释配制成半成品。本公开的生产乙型肝炎疫苗的方法可大大降低产品污染率，提高了抗原回收率，加快了产业化进程，减轻人工劳动强度，节省设备投资和维修成本，缩短生产时间，实现全密闭管道化生产。

44、第三方面，本公开提供生产乙型肝炎疫苗的方法，所述方法包括：

45、由第二方面所述的方法制备得到乙肝表面抗原原液，利用甲醛处理所述乙肝表面抗原原液，获得乙肝表面抗原甲醛处理液；

46、在搅拌条件下，将ph为3.0～4.2，铝离子浓度为0.12～0.21mol/l的硫酸铝钾溶液加入到所述乙肝表面抗原甲醛处理液中，之后利用0.5～2.0mol/l的氢氧化钠溶液调节ph为6.0～8.0，优选为6.5～7.5，获得乙肝铝吸附产物，再经疫苗稀释液稀释配制成乙型肝炎疫苗半成品。

47、在一些实施方案中，乙肝表面抗原甲醛处理液中的乙肝表面抗原的浓度为260-340μg/ml。

48、在一些实施方案中，搅拌速度为100～700rpm，优选为400～600rpm。

49、在一些实施方案中，硫酸铝钾溶液的ph为3.5～4.0，铝离子的浓度为0.14～0.18mol/l，氢氧化钠溶液的浓度为1.0～1.5mol/l。

50、在一些实施方案中，硫酸铝钾溶液的ph为3.0～4.2，优选为3.5～4.0。

51、第四方面，本公开提供由第三方面的方法制备的乙型肝炎疫苗。

52、在一些实施方案中，所述乙型肝炎疫苗中的乙肝表面抗原的含量为20-24μg/ml。

53、在一些实施方案中，所述乙型肝炎疫苗中的铝离子的含量为0.35-0.60mg/ml。

54、在一些实施方案中，所述乙型肝炎疫苗半成品的ph为6.5～7.5。

55、本公开提供的生产乙肝疫苗的方法通过三级发酵能够提高乙肝表面抗原的产量。并且生产工艺易于放大以及产业化，缩短生产时间，有利于乙型肝炎疫苗的大规模生产。不仅如此，该生产乙肝疫苗的方法还大大降低抗原和疫苗生产成本。

56、本公开利用三级发酵方式获得了表达hbsag的汉逊酵母菌体，快速且高效地获得了含有hbsag的汉逊酵母，并通过中空纤维收集酵母菌体，并利用分步沉降(peg沉降)及特异性吸附(硅胶吸附工艺)的方式，在粗纯化步骤就去除了抗原提取物中的大量杂质，从而精纯步骤利用两步超滤的方式，浓缩了料液，除去杂蛋白的同时减少了纯化的时间，通过两步层析(阴离子交换和凝胶过滤层析)将抗原提取物进一步纯化，并最终得到体外效价高的乙肝疫苗，操作方便快捷，易重复，易放大生产，缩短了生产的时间成本。