一种检测栽培稻杂种不育中性基因座ARSL1-n的分子标记、方法和应用

本发明属于作物遗传育种，更具体地，涉及一种检测栽培稻杂种不育中性基因座arsl1-n的分子标记、方法和应用。

背景技术：

1、栽培稻分为亚洲栽培稻(oryza sativa)和非洲栽培稻(oryza glaberrima)，亚洲栽培稻进一步分为籼稻和粳稻两个亚种。与亚种内的品种间杂种优势相比，亚种间或种间杂种具有更明显的优势，因此亚种间或种间的杂种优势利用是杂交稻的未来发展方向。但(亚)种间存在严重的杂种不育现象，导致杂种f1植株的结实率只有0-30％，使得其产量优势无法得到体现，这严重限制了远缘杂交稻的发展。因此，分离杂种不育基因并建立相关的杂种亲和系对克服远缘杂交生殖障碍，突破杂交水稻增产瓶颈至关重要。

2、到目前为止，已鉴定出至少21个亚非栽培稻种间杂种不育基因座(garavito etal.,2010；xu et al.,2014；zin mar et al.,2021；wang et al.,2022)，但仅报道克隆了一个基因座s1(xie et al.,2017a；koide et al.,2018；xie et al.,2019)。这些杂种不育基因座通常显示出特定等位基因的遗传优势传递，导致后代群体的偏分离现象，因此，杂种不育基因座位也被称为自私遗传元件。大多数亚非栽培稻杂种不育基因座是非洲栽培稻自私的基因座，即表现出非洲栽培稻等位基因的传递优势。例如，在具有s1杂合基因型的亚非栽培稻杂种f1中，携带亚洲栽培稻等位基因(s1-s)的雌性和雄性配子同时发生败育，而携带非洲栽培稻等基因(s1-g)的雌性和雄性配子则被选择性地保护而存活下来，表现出s1-g等位基因的自私传递(xie et al.,2017a)。尽管取得了这些进展，但我们对自私遗传基因座位，特别是亚洲栽培稻自私基因座位导致非亚栽培稻杂种不育的认知还非常有限。

3、为了利用水稻远缘杂种优势，遗传育种家采取了几种方法来克服杂种不育。第一种方法是：通过鉴定携带杂种不育中性或亲和型基因座的自然亲和品系，如粳稻品种02428和籼稻品种dular，用于克服籼粳杂种不育(chen et al.,2008；yang et al.,2012；wanget al.,2006)。所述的杂种不育中性或亲和型基因座，是指以含有此类基因座的亲本与含有等位的杂种不育(不亲和)基因座的亲本杂交，其杂种的该杂合座位不能产生杂种不育的变异型基因座。第二种方法是：在粳稻品系中聚合某些杂种不育基因座的籼稻等位基因座或中性基因座，培育“粳型亲籼系”，从而打破籼粳杂种不育(guo et al.,2016；mi et al.,2016)。第三种方法是：利用基因编辑敲除杂种不育功能基因，创建杂种不育基因座的人工中性基因座位，也是克服杂种不育的有效途径(xie et al.,2017a；xie et al.,2017b)。这些研究表明，含有杂种不育中性基因座的品种是克服远缘杂种不育和利用远缘杂种优势的重要种质资源。然而，鉴定杂种不育中性基因座的有效方法仍然有限。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一套用于检测栽培稻杂种不育中性基因座arsl1-n的分子标记。

2、本发明的第二个目的在于提供分子标记的应用。

3、本发明的第三个目的在于提供一种鉴定携带中性基因座位arsl1-n的水稻品系的方法。

4、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

5、本发明利用亚洲栽培稻品系02428与非洲栽培稻品系cg14配组杂交获得杂种f1，然后利用02428为轮回亲本，连续回交5代后，分离到一个表现出雄性半不育的植株nil-arsl1(he)。用分子标记对nil-arsl1(he)进行全基因组扫描，鉴定到一个导致亚非栽培稻种间花粉半不育的基因座位arsl1。进一步将arsl1定位在第1号染色体长臂上的分子标记m42.21和m42.40之间的186kb区间内；

6、其中左侧翼分子标记m42.21的引物序列为：

7、m42.21f：5’-tgacgaagtactcgcagtcgaa-3’(如序列seq id no：17所示)；

8、m42.21r：5’-gcatcaacctgtatcacgtatgg-3’(如序列seq id no：18所示)；

9、右侧翼分子标记m42.40的引物序列为：

10、m42.40f：5’-gcgtgatgttctcgctagtt-3’(如序列seq id no：25所示)；

11、m42.40r：5’-gcgacgctgggtttgttgat-3’(如序列seq id no：26所示)。

12、所述基因座位arsl1包含的基因型可以决定亚洲栽培稻和非洲栽培稻种间杂种花粉是否败育；该基因座位导致亚非栽培稻种间杂种花粉不育的具体表现是：基因座位arsl1杂合时，携带非洲栽培稻基因型arsl1-g的花粉败育，携带亚洲栽培稻基因型arsl1-s的花粉可育，因而arsl1-s在杂种后代表现出优势传递，即基因座位arsl1为亚洲栽培稻自私基因座位。

13、本发明进一步通过比较基因组分析，发现一些亚洲栽培稻种质在该基因座位arsl1区间存在约140kb的大片段dna缺失，代表一种中性或亲和基因座位arsl1-n；将含有arsl1-n的亲本和其它亚洲稻(含arsl1-s)或非洲稻(含arsl1-g)亲本杂交，其杂种中此座位不产生杂种不育，f2中的arsl1等位基因型的分离比不偏离孟德尔遗传规律，显示arsl1-n对arsl1-s和arsl1-g基因座具有杂种亲和性，arsl1-n为arsl1的中性等位基因座位，能够有效克服arsl1介导的杂种不育现象。

14、基于此，本发明根据杂种不育基因座位arsl1-s、arsl1-g及其arsl1-n的序列特征，开发了一套分子标记(p1～p4)用于检测arsl1的中性基因座位arsl1-n。

15、所述用于检测栽培稻杂种不育中性基因座arsl1-n的分子标记，其特征在于，包括分子标记引物p1～p4，其序列依次如seq id no：33～36所示：

16、p1序列：5’-ggatggacaacgatgacttc-3’(如序列seq id no：33所示)；

17、p2序列：5’-gcgacgtcagtaaccatgta-3’(如序列seq id no：34所示)；

18、p3序列：5’-gccaacttgcggacattgta-3’(如序列seq id no：35所示)；

19、p4序列：5’-cgtatggtgtgcctgcgatt-3’(如序列seq id no：36所示)。

20、所述p1/p2和p3/p4用于分别扩增arsl1-s/arsl1-g基因座左侧和右侧的约2kb的片段，但不能扩增arsl1-n座位的片段；p1/p4用于扩增arsl1-n座位约7kb的特异片段，但不能扩增arsl1-s/arsl1-g座位的此区间140kb的片段。通过结合引物组p1/p2，p3/p4，p1/p4的扩增结果，用于鉴定不同栽培稻是否携带杂种不育中性基因座位arsl1-n。

21、含有杂种不育中性基因座的品种是克服远缘杂种不育和利用远缘杂种优势的重要种质资源。因此本发明还提供所述分子标记在鉴定携带杂种不育中性基因座位arsl1-n的水稻品系或在制备鉴定携带杂种不育中性基因座位arsl1-n的水稻品系的试剂盒中的应用。

22、更具体地，所述分子标记可应用于鉴定携带arsl1-n中性基因座位的水稻品系；也可应用于利用含arsl1-n中性基因座的品系作为供体亲本，通过杂交和回交结合上述提供的分子标记进行辅助筛选，将其导入到其它栽培稻品系中，从而育成携带arsl1-n中性基因座位的杂种亲和系新种质。

23、优选地，所述水稻品系包括水稻自然亲和品系，或人工育成的携带中性基因座位arsl1-n的水稻杂种亲和系。

24、一种鉴定携带中性基因座位arsl1-n的水稻品系的方法，包括如下步骤：

25、s1.以不同栽培稻品种基因组dna为模板，利用上述分子标记引物p1～p4中的三个引物组p1/p2，p3/p4，p1/p4分别进行pcr扩增反应；

26、s2.对步骤s1的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果，将p1/p4能扩增7kb的特异片段，同时p1/p2和p3/p4不能扩增条带的材料判定为携带中性基因座位arsl1-n的水稻品系；将p1/p4不能扩增7kb的特异片段，而p1/p2和p3/p4能分别扩增2kb的特异片段的材料判定为携带arsl1-s/arsl1-g座位的栽培稻种质。

27、优选地，所述pcr反应体系：50～100ng/μl模板dna 1μl，10μmol/l p1或p3 0.5μl，10μmol/l p2或p4 0.5μl，1u/μl apexhf hs dna polymerase cl0.5μl，2×apexhf clbuffer 10μl，ddh2o 7.5μl，共20μl。

28、优选地，所述pcr反应程序：94℃变性3min；98℃变性20s、58℃退火20s、使用p1/p2和p3/p4时延伸2min，使用p1/p4时延伸7min，共循环31次；68℃延伸3min。

29、本发明还提供一种用于检测栽培稻杂种不育中性基因座arsl1-n的试剂盒，包括上述分子标记引物p1～p4。

30、优选地，所述试剂盒还包括pcr扩增反应所需试剂。

31、在利用上述分子标记鉴定到携带中性基因座位arsl1-n的水稻品系后，可以利用该携带arsl1-n的亲和系与亚洲栽培稻(含arsl1-s)或非洲稻(含arsl1-g)亲本杂交，产生育性正常的杂种，从而应用于克服arsl1座位的杂种育性障碍，促进杂种优势的有效利用。

32、因此本发明还提供上述任一所述鉴定携带中性基因座位arsl1-n的水稻品系的方法在远缘杂交水稻分子育种的应用，即在克服亚非栽培稻种间或籼粳稻亚种间杂种不育中的应用。

33、具体地，所述应用为将上述方法鉴定得到的携带arsl1-n的亲和系与含arsl1-s的亚洲栽培稻或含arsl1-g的非洲稻亲本杂交，产生育性正常的杂种。

34、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

35、本发明提供了一种检测栽培稻杂种不育中性基因座arsl1-n的分子标记、方法和应用。本发明首先发现了一个栽培稻种间杂种不育座位arsl1，位于第1号染色体长臂上的分子标记m42.21和m42.40之间186kb的区间内，进而通过比较基因组分析，发现了一种在arsl1座位含有染色体片段缺失的中性或亲和型等位基因座位arsl1-n，arsl1-n对arsl1-s和arsl1-g基因座具有杂种亲和性。由此提供了一套用于检测基因座位arsl1-n的分子标记、方法，用于检测鉴定含arsl1-n座位的水稻品系，从而以arsl-n座位克服arsl1介导的杂种育性障碍。本发明为远缘杂种优势利用奠定了技术基础，在远缘杂交水稻分子育种具有重要应用价值。