E基因突变的重组鸭坦布苏病毒及其制备方法、疫苗

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种e基因突变的重组鸭坦布苏病毒及其制备方法、疫苗。

背景技术：

1、鸭坦布苏病毒(dtmuv)可导致鸭产蛋量大幅下降，死亡率大幅上升，传统疫苗保护效力差，需要多次接种，给养鸭业带来了巨大的经济负担。dtmuv属于黄病毒属，黄病毒科。其基因组只有一个长的独立开放阅读框，编码3个结构蛋白：核衣壳(c)、膜(m)和包膜(e)；以及7个非结构蛋白：ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4bns5。其中，e蛋白的n糖基化对于病毒的复制、感染性及毒力有重要影响。目前现有文献对于e蛋白n-糖基化的研究都是针对糖基化位点的缺失，如宰俊杰通过对日本乙型脑炎病毒e蛋白第154位氨基酸进行突变，导致了该处糖基化位点的缺失，发现突变后的质粒表达的绝大部分e蛋白构象被破坏，无法被正确折叠，而仅少数的e蛋白具有正确构象，其折叠效率被大打折扣。而增加的糖基化位点对病毒毒力是否会有影响还需进一步研究。因此，构建e基因突变的鸭坦布苏病毒具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种e基因突变的重组鸭坦布苏病毒及其制备方法、疫苗，其实现了e基因的突变，为后续疫苗的研究提供了基础。

2、本发明还要解决的技术问题在于，提供上述的突变鸭坦布苏病毒的应用。

3、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其包括以下步骤：

4、(1)提供/制备含有e基因片段的质粒；

5、(2)采用核苷酸序列如seq id no.1～4所示的引物，以含有e基因片段的质粒为模板进行pcr扩增，得到e-r166k片段和e-d37n片段；

6、(3)将所述e-r166k片段、e-d37n片段同源重组，得到突变质粒e dⅰd37n r166k；

7、(4)将所述突变质粒e di d37n r166k与pf2质粒、pf3质粒、pf4质粒连接，转录为rna后转染细胞，即得到e基因突变的重组鸭坦布苏病毒。

8、作为上述技术方案的改进，其特征在于，步骤(1)中，所述含有e基因片段的质粒为pf1质粒。

9、作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，采用核苷酸序列如seq no.1和seq no.4所述的引物对pf1质粒进行pcr扩增，得到e-d37n片段；

10、其中，pcr反应体系包括：2×max buffer 10μl，dntp 4μl，引物各1μl，pf1质粒1μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 0.5μl，水32.5μl；

11、pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸8min，共32个循环；最后72℃延伸10min。

12、作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，采用核苷酸序列如seq no.2和seq no.3所述的引物对pf1质粒进行pcr扩增，得到r166k片段；

13、其中，pcr反应体系包括：2×max buffer 10μl，dntp 4μl，引物各1μl，pf1质粒1μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 0.5μl，水32.5μl；

14、pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸8min，共32个循环；最后72℃延伸10min。

15、作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，将所述e-r166k片段、e-d37n片段分别进行消化，然后进行同源重组；

16、其中，消化反应体系包括：e-r166k片段或e-d37n片段50μl，dpnⅰ酶1μl；

17、消化反应条件为，在30-40℃恒温反应1-2h。

18、作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，将消化后的e-r166k片段、e-d37n片段同源重组，然后转化到dh5α感受态细菌，培养提取得到突变质粒e dⅰd37n r166k；

19、其中，同源重组的反应体系包括：消化后e-r166k片段600ng，e-d37n片段500ng，5×ce ii buffer 4μl，exnase ii 2μl，水补足至20μl；

20、重组反应的反应条件为：在30-40℃反应0.2-1h。

21、作为上述技术方案的改进，步骤(4)中，分别将突变质粒e di d37n r166k与pf2质粒、pf3质粒、pf4酶切线性化，分别得到f1片段、f2片段、f3片段和f4片段，然后连接；

22、其中，酶切体系包括：esp3 i酶4μl，cutsmart缓冲液5μl，各质粒5μg，水补足至50μl；

23、酶切反应条件为，在30-40℃反应4-5h；

24、其中，连接体系包括：f1片段520ng，f2片段470ng，f3片段600ng，f4片段62ng，10×t4 dna ligase buffer 1μl，t4 ligase 1μl，水补足至10μl；

25、连接反应条件为：在15-20℃反应8-24h。

26、作为上述技术方案的改进，将连接产物转录为rna，然后转染至bhk-21细胞，培养后得到e基因突变的重组鸭坦布苏病毒；

27、其中，转录体系包括：连接产物1μg，2×ntp/cap 10μl，10×reaction buffer

28、2μl，gtp 1μl，t7 rnapol enzyme 2μl，rnase-free water补足至20μl；

29、转录反应条件为：30-40℃反应2-4h。

30、相应的，本发明还公开了一种e基因突变的重组鸭坦布苏病毒，其由上述的制备方法制备而得。

31、相应的，本发明还公开了一种鸭坦布苏病毒疫苗，其包括上述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒。

32、实施本发明，具有如下有益效果：

33、本发明制备了e基因突变的重组鸭坦布苏病毒，其实现了e基因的突变，为后续抗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备提供了良好的平台。

技术特征：

1.一种e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含有e基因片段的质粒为pf1质粒。

3.如权利要求2所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用核苷酸序列如seq no.1和seq no.4所述的引物对pf1质粒进行pcr扩增，得到e-d37n片段；

4.如权利要求2所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用核苷酸序列如seq no.2和seq no.3所述的引物对pf1质粒进行pcr扩增，得到e-r166k片段；

5.如权利要求1所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将所述e-r166k片段、e-d37n片段分别进行消化，然后进行同源重组；

6.如权利要求5所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将消化后的e-r166k片段、e-d37n片段同源重组，然后转化到dh5α感受态细菌，培养提取得到突变质粒e dⅰd37n r166k；

7.如权利要求1所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，分别将突变质粒e did37n r166k与pf2质粒、pf3质粒、pf4酶切线性化，分别得到f1片段、f2片段、f3片段和f4片段，然后连接；

8.如权利要求7所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒的制备方法，其特征在于，将连接产物转录为rna，然后转染至bhk-21细胞，培养后得到e基因突变的重组鸭坦布苏病毒；

9.一种e基因突变的重组鸭坦布苏病毒，其特征在于，由如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备而得。

10.一种鸭坦布苏病毒疫苗，其特征在于，包括如权利要求9所述的e基因突变的重组鸭坦布苏病毒。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开了一种E基因突变的重组鸭坦布苏病毒及其制备方法、疫苗。本发明制备了突变质粒E DⅠD37N R166K，进而构建了E基因突变的重组鸭坦布苏病毒株rDTMUV E DⅠD37N R166K。该毒株可为后续抗鸭坦布苏病毒的药物、疫苗的制备提供了良好的平台。

技术研发人员：向程威,杨泽坤,王婷,杨洁,陈瑞爱
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14