阿魏酸生物转化为香草醛的制作方法

本公开总体上涉及使用阿魏酸作为原料发酵产生天然香草醛的微生物和生物转化方法。可用于本发明的微生物可以在不将任何外源性核酸序列引入微生物细胞的情况下进行基因工程化。因此，可用于将阿魏酸生物转化为香草醛的本发明的微生物是非基因修饰的生物体(非gmo)。

背景技术：

1、香草香精是世界上最常用的香精之一。其被用于许多食品的调味品，如冰淇淋、乳制产品、甜点、糖果、烘焙产品和烈酒。其也被用于香水、药品和个人卫生产品。

2、传统上，天然香草香精是从香草兰(vanilla planifolia)的发酵荚中获得的。其主要是在收获后，在豆类的干燥和发酵过程的若干星期内，通过存在于豆类中的香草醛葡萄糖苷的水解而形成的。香草香精的基本芳香物质是香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)。

3、每年消耗约12,000吨香草醛，其中只有20吨至50吨是从香草豆中提取的，其余是合成产生的，主要来自石化衍生的愈创木酚。近年来，对于使用可再生原料(如衍生自米糠中的阿魏酸、来自云杉木质素的松柏醇、来自丁香油的玉米糖和丁香酚)通过生物发酵产生香草醛的兴趣日益增加。使用生物发酵衍生自可再生原料的香草醛被监管和立法机构认定为“天然香草醛”，并且可以作为“天然产品”销售。

4、放线菌拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)菌株atcc 39116已用于将阿魏酸生物转化为香草醛。已知这种微生物通过四种主要途径代谢阿魏酸，所述四种途径与初始反应不同，即非氧化性脱羧、侧链还原、辅酶a非依赖性脱乙酰和辅酶a依赖性脱乙酰。放线菌拟无枝酸菌菌株atcc 39116内阿魏酸代谢的辅酶a依赖性脱乙酰途径包含两个步骤。在第一步中，对阿魏酸进行非氧化脱乙酰以产生香草醛(图1)。此步骤由两种酶介导，即由fcs基因编码的阿魏酰-辅酶a(coa)合成酶和由ech基因编码的烯酰-coa水合酶/醛缩酶。两个基因(ech和fcs)都在单个操纵子内，当放线菌拟无枝酸菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长时，这两个基因的表达受到抑制。只有在添加阿魏酸之后，这些基因的转录才被诱导。结果，当将阿魏酸添加到培养基中时，在可以检测到香草醛合成之前存在约5小时或更长的滞后时间段。通常，滞后时间段为至少4小时，并且至多8小时。一旦香草醛积累，阿魏酸代谢的第二阶段就开始了。在第二步中，香草醛经过β氧化产生香草酸。香草醛转化为香草酸是由vdh基因编码的香草醛脱氢酶介导的。为了增加香草醛产生，需要进行生物工程化，使得阿魏酸向香草醛生物转化在没有任何滞后时间段的情况下开始，并且香草醛向香草酸的转化被阻断或显著降低。

技术实现思路

1、本发明提供了一种新方法，用于基因工程化放线菌拟无枝酸菌以增加由阿魏酸产生的香草醛。根据本发明基因工程化的放线菌拟无枝酸菌不携带任何外源性核酸序列，并且可以被认定为非基因修饰的生物体(非gmo)。

2、本发明提供了一种使用阿魏酸作为原料产生香草醛的生物转化方法。本发明的微生物最初在含葡萄糖的生长培养基中生长，并且通过向所述培养基中添加阿魏酸来启动香草醛的发酵产生。在本发明的一个优选实施例中，所述微生物可以是放线菌目(orderactinomycetales)和拟无枝酸菌属(genus amycolatopsis)。例如，微生物可以是可在编号atcc 39116下获得的拟无枝酸菌菌株。与野生型对应物不同，本发明的突变型菌株可以在没有任何滞后时间段的情况下从阿魏酸开始发酵产生香草醛。本菌株可以使用化学诱变获得，并且赋予使用阿魏酸产生香草醛而没有任何滞后时间段的表型的遗传突变的性质可以通过使用全基因组测序来鉴定。

3、在拟无枝酸菌中，阿魏酸生物转化为香草醛是通过两种酶进行的；即由ech基因编码的烯酰-coa水合酶/醛缩酶和由fcs基因编码的阿魏酰-辅酶a(coa)合成酶。拟无枝酸菌中的ech和fcs基因位于单个操纵子(ech-fcs操纵子)内，并且由单个启动子控制。当拟无枝酸菌在含葡萄糖的培养基中生长时，ech-fcs操纵子的转录受到抑制。当添加阿魏酸时，尽管需要若干小时才能检测到阿魏酸生物转化为香草醛，但对ech-fcs操纵子的抑制会减轻。

4、在本发明的一方面，对拟无枝酸菌atcc 39116的孢子进行化学诱变(例如，使用甲磺酸甲酯)，并且可以筛选得到的菌落以选择其中ech-fcs操纵子已经克服抑制的突变型菌株。使用全基因组测序，本发明人出乎意料地发现，具有期望的香草醛产生表型而没有滞后时间段的突变型菌株在内源性基因中包括一个或多个突变，所述内源性基因包括seq idno:4(本发明人将其命名为echr基因，因为其编码ech-fcs操纵子的阻遏蛋白)的核苷酸序列。此echr蛋白包括seq id no:5的氨基酸序列，并且被发现含有marr型转录阻遏蛋白结构域。根据本发明，根据本发明的突变型菌株可以包含echr基因中的一个或多个突变，所述突变选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变以及其组合，其中此类突变能够引起echr蛋白的功能失活，从而导致ech-fcs操纵子的去抑制。

5、另一方面，本发明涉及在使用阿魏酸作为原料的香草醛产生中，echr基因中的一个或多个突变导致echr蛋白功能失活的作用。在一个实施例中，本发明涉及具有功能失活的echr基因的拟无枝酸菌突变型菌株，其能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。在本发明的另一个实施例中，具有功能失活的echr基因的拟无枝酸菌突变型菌株在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内可以产生至少0.75g香草醛/升培养基。在本发明的又另一个实施例中，具有功能失活的echr基因的拟无枝酸菌突变型菌株在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的3小时内可以产生至少0.5g香草醛/升培养基。

6、在本发明的一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echr基因中没有突变的野生型菌株相比时，在包括seq id no:4的核酸序列的内源性echr基因上具有一个或多个突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少100％的香草醛。在本发明的另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echr基因中没有突变的野生型菌株相比时，在具有如seq idno:4的核酸序列的内源性echr基因中具有突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少200％的香草醛。在本发明的又另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echr基因中没有突变的野生型菌株相比时，在具有如seq idno:4的核酸序列的内源性echr基因上具有突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少300％的香草醛。在本发明的另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echr基因中没有突变的野生型菌株相比时，在具有如seq idno:4的核酸序列的内源性echr基因上具有突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少400％的香草醛。

7、在另一个实施例中，本发明提供了一种用于防止在具有内源性echr基因中的突变的拟无枝酸菌菌株内使用阿魏酸产生的香草醛的分解代谢的方法。一旦香草醛在拟无枝酸菌细胞内产生，其就会通过由vdh基因编码的香草醛脱氢酶(vdh)转化为香草酸。在本发明的一方面，对vdh基因进行一种或多种无标志物的基因修饰；例如，通过使用crispr技术或本领域技术人员已知的任何其它合适的重组dna技术，使得香草醛脱氢酶基因在拟无枝酸菌细胞内不再具有功能。香草醛脱氢酶的功能失活可以通过突变vdh基因来实现。根据本发明，vdh基因中能够引起香草醛脱氢酶功能失活的任一个突变(选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变和点突变)将阻止香草醛转化为香草酸。

8、一方面，本公开涉及一种使用在echr基因中具有突变的分离的基因工程化拟无枝酸菌菌株产生香草醛的方法。进一步地，本拟无枝酸菌菌株的特征在于不具有外源性核酸分子，并且因此可以被认定为非基因修饰的生物体(非gmo)。在一些实施例中，由阿魏酸产生香草醛的本生物转化方法可以包含(i)在培养基中培养分离的非gmo宿主细胞；(ii)向培养基中添加阿魏酸以开始将阿魏酸生物向香草醛的生物转化；以及(iii)从培养基中提取香草醛。

9、本文所描述的生物转化方法可以包含从混合物中回收香草醛。香草醛的回收可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行。在回收香草醛之前，所述方法还可以包含从发酵混合物中去除生物质(酶、细胞材料等)。

10、使用本文所描述的方法和/或分离的重组宿主细胞产生的香草醛可以被收集、纯化，并且掺入许多可消费产品中。例如，香草醛可以与可消费产品混合。在一些实施例中，香草醛可以以足以赋予、改变、促进或增强期望的味道、风味或感觉的量掺入可消费产品中，或以隐藏、改变或最小化可消费产品的不期望的味道、风味或者感觉的量掺入可消费产品中。例如，可消费产品可以选自由以下组成的组：食品、食品成分、食品添加剂、饮料、药品和烟草。例如，可消费产品可以选自由以下组成的组：香水、化妆品、洗漱用品、家庭和身体护理、洗涤剂、驱蚊剂、肥料、空气清新剂和肥皂。

11、第一实施例是非gmo拟无枝酸菌突变型菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基，在此实施例中，所述菌株是非天然存在的，在一些实施例中，所述菌株是非天然存在的菌株。

12、第二实施例是第一实施例的菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基，在此实施例中，所述菌株是非天然存在的。

13、第三实施例是第一实施例的菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基，在此实施例中，所述菌株是非天然存在的。

14、第四实施例是第一至第三实施例的菌株，其中所述突变型菌株包括具有seq idno:4的核酸序列的内源性基因中的突变，其中所述突变减少或消除ech-fcs操纵子的抑制。

15、第五实施例是第一至第四实施例的菌株，其中所述菌株编码在seq id no:5的氨基酸序列中具有突变的内源性蛋白。

16、第六实施例是第一至第五实施例的突变型菌株，其进一步包含具有seq id no:6的核酸序列的vdh基因中的突变。

17、第七实施例是第四实施例的突变型菌株，其中所述突变是缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变。

18、第八实施例是第七实施例的突变型菌株，其中所述突变是缺失。

19、第九实施例是第七实施例的突变型菌株，其中所述突变是移码突变。

20、第十实施例是第七实施例的突变型菌株，其中所述突变是启动子突变。

21、第十一实施例是第一至第十实施例的菌株，其中所述菌株是可在编号atcc 39116下获得的菌株拟无枝酸菌的突变体。

22、第十二实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少100％的香草醛。

23、第十三实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少200％的香草醛。

24、第十四实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少300％的香草醛。

25、第十五实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少400％的香草醛。

26、第十六实施例是第一至第十五实施例的突变型菌株，其中通过使用基于无标志物crispr的重组dna技术获得所述突变型菌株，而不通过引入任何外源性遗传物质对所述突变型菌株进行永久修饰。

27、第十七实施例是第一至第十五实施例的突变型菌株，其中所述突变型菌株是通过使菌株与突变原甲磺酸甲酯接触获得的。

28、第十八实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。第十九实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的5小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。

29、第二十实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。

30、第二十一实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。

31、第二十二实施例是第十八至第二十一实施例的菌株，其包括：具有seq id no:4的核酸序列的基因中的突变，其中所述突变减少或消除ech-fcs操纵子的抑制。

32、第二十三实施例是第十八至第二十一实施例的菌株，其中所述菌株中的基因编码在seq id no:5的氨基酸序列中具有突变的蛋白质。

33、第二十四实施例是第十八至第二十三实施例的菌株，其包含具有seq is no:6的核酸序列的vdh基因中的突变。

34、第二十五实施例是第十八至第二十四实施例的菌株，其中所述突变是缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变。

35、第二十六实施例是第二十五实施例的菌株，其中所述突变是缺失。

36、第二十七实施例是第二十五实施例的菌株，其中所述突变是移码突变。

37、第二十八实施例是第二十五实施例的菌株，其中所述突变是启动子突变。

38、第二十九实施例是第十八至第二十八实施例的菌株，其中所述菌株源自可在编号atcc 39116下获得的拟无枝酸菌。

39、第三十实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少100％的香草醛。

40、第三十一实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少200％的香草醛。

41、第三十二实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少300％的香草醛。

42、第三十三实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有seq id no:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少400％的香草醛。

43、第三十四实施例是产生香草醛的方法，其包括在包括底物的适当培养基中培养第一至第三十三实施例中任一项所述的菌株，并且回收产生的香草醛。

44、第三十五实施例是一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：在含有碳源的培养基中培养第一至第十七实施例中任一项所述的拟无枝酸菌突变型菌株；以及将阿魏酸进料给所述突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间段。

45、第三十六实施例是一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：在含有碳源的培养基中培养第十八至第三十三实施例中任一项所述的拟无枝酸菌菌株；以及将阿魏酸进料给所述菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间段。

46、本发明的其它特征和优点将在以下参考附图的详细描述中变得显而易见。