一种快速鉴定外源cop-GFP的方法

本发明涉及基因检测，尤其涉及一种快速鉴定外源cop-gfp的方法。

背景技术：

1、cop-gfp是一种加强荧光蛋白，在动物体内表达后发绿色荧光。通常是作为一种报告基因来检测基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。通常cop-gfp的表达鉴定方法主要包括：将外源基因转到动物体内后在48～72小时是使用荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达，或者是用流式细胞仪或者是紫外分光光度计来判断荧光蛋白的表达。然而，使用荧光显微镜观察虽可以判断细胞是否有绿色荧光蛋白的表达，但是无法定量判断荧光基因表达量的高低，使用流式细胞仪检测cop-gfp绿色荧光的表达，虽然准确效率高而且能够定量分析，准确判断荧光表达量的高低，但是需要抗体和流式细胞仪所需设备条件较为苛刻，而且无法检测体外的外源的cop-gfp的表达。因此，需要提供一种较为快捷、稳定的可以同时定性并且定量的方法来检测cop-gfp基因的表达。

技术实现思路

1、为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种快速鉴定外源cop-gfp的方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，包括如下步骤：

4、(1)根据cop-gfp的dna序列设计合成地高辛探针；

5、(2)使用离心柱纯化法提取待测样本的dna；

6、(3)将所述待测样本的dna进行煮沸处理后加到薄膜上；

7、(4)待膜风干后置于2×ssc缓冲液中浸泡；

8、(5)浸泡结束后使用紫外交联将dna固定在膜上；

9、(6)固定结束后将膜dna面与预杂交液混合进行预杂交，得预杂交膜；

10、(7)将步骤(1)所得地高辛探针进行煮沸变性后冷却，然后与杂交液混合，得混合液2；

11、(8)将步骤(6)所得预杂交膜与步骤(7)所得混合液混合进行杂交过夜，然后使用0.5×ssc溶液进行漂洗，得探针交联膜；

12、(9)使用核酸检测试剂盒对所述探针交联膜进行显影实验。

13、优选的，步骤(1)中所述cop-gfp的dna序列如seq id no.1所示。

14、优选的，步骤(1)中所述地高辛探针的dna序列如seq id no.2所示。

15、优选的，步骤(2)中所述待测样本的dna的提取浓度≥100ng/μl。

16、优选的，步骤(3)中所述煮沸处理的时间为4～6min，步骤(3)中所述薄膜包括硝酸纤维素膜或尼龙膜，步骤(4)中所述浸泡的时间为15～25min。

17、优选的，步骤(5)中所述紫外交联的时间为55～65s。

18、优选的，步骤(6)中所述预杂交液包括如下组分：25～35ml20×ssc缓冲液，8～12ml50×denhardt’s，4～6ml10×sds，0.5～1.5mlsalmondna和50～55mldh2o，所述salmondna的浓度为8～12mg/ml，所述预杂交液的用量为占膜面积的1～2ml/cm2，所述预杂交的温度为55～65℃，所述预杂交的时间为3.5～4.5h。

19、优选的，步骤(7)中所述煮沸变性的时间为4～6min，所述杂交液包括如下组分：25～35ml20×ssc缓冲液，8～12ml50×denhardt’s，4～6ml10×sds和50～55mldh2o，所述杂交液的用量为占膜面积的4～6ml/cm2。

20、优选的，步骤(8)中所述杂交的温度为55～65℃，所述0.5×ssc溶液含有8～12％的sds，所述漂洗的次数为1～3次，每次漂洗的时间为15～25min。

21、优选的，步骤(9)中所述核酸检测试剂盒包括化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

23、本发明可以较快地检测到cop-gfp绿色荧光在细胞内的表达。且本发明可以一次检测多个样品，并且后续可以通过斑点印迹分析cop-gfp在细胞内的表达量。

技术特征：

1.一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(1)中所述cop-gfp的dna序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(1)中所述地高辛探针的dna序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(2)中所述待测样本的dna的提取浓度≥100ng/μl。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(3)中所述煮沸处理的时间为4～6min，步骤(3)中所述薄膜包括硝酸纤维素膜或尼龙膜，步骤(4)中所述浸泡的时间为15～25min。

6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(5)中所述紫外交联的时间为55～65s。

7.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(6)中所述预杂交液包括如下组分：25～35ml 20×ssc缓冲液，8～12ml50×denhardt’s，4～6ml 10×sds，0.5～1.5ml salmon dna和50～55ml dh2o，所述salmon dna的浓度为8～12mg/ml，所述预杂交液的用量为占膜面积的1～2ml/cm2，所述预杂交的温度为55～65℃，所述预杂交的时间为3.5～4.5h。

8.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(7)中所述煮沸变性的时间为4～6min，所述杂交液包括如下组分：25～35ml 20×ssc缓冲液，8～12ml 50×denhardt’s，4～6ml 10×sds和50～55ml dh2o，所述杂交液的用量为占膜面积的4～6ml/cm2。

9.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(8)中所述杂交的温度为55～65℃，所述0.5×ssc溶液含有8～12％的sds，所述漂洗的次数为1～3次，每次漂洗的时间为15～25min。

10.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop-gfp的方法，其特征在于，步骤(9)中所述核酸检测试剂盒包括化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒。

技术总结
本发明属于基因检测技术领域，本发明提供了一种快速鉴定外源cop‑GFP的方法。本发明根据cop‑GFP的DNA序列设计合成地高辛探针，使用离心柱纯化法提取待测样本的DNA，将所述待测样本的DNA进行煮沸处理后加到薄膜上，将膜DNA面与预杂交液混合进行预杂交，再取出与含地高辛探针的杂交液混合进行杂交过夜，漂洗得探针交联膜，最后使用核酸检测试剂盒对所述探针交联膜进行显影实验，判定结果。本发明可以较快地检测到cop‑GFP绿色荧光在细胞内的表达。且本发明可以一次检测多个样品，并且后续可以通过斑点印迹分析cop‑GFP在细胞内的表达量。

技术研发人员：靳锴,高嘉晨,左其生,韩威,陈国宏,李碧春
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12