一种用于荧光染色的重组蓝舌病毒及其构建方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于荧光染色的重组蓝舌病毒及其构建方法。

背景技术：

1、蓝舌病是由蓝舌病毒(bluetongue virus，btv)引起的一种严重侵害羊、牛、鹿等反刍动物的烈性传染病，世界动物卫生组织(woah)将其列为法定通报的动物传染病，我国将其列为二类动物传染病。btv是呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(orbivirus)的代表性成员，是一种由库蠓(culicoides)传播的虫媒病毒，目前已发现29种不同的血清型，型与型之间不能交叉免疫。

2、btv粒子为二十面立体对称，无囊膜，其基因组由10个(s1～s10)分节段的线性双链rna(dsrna)组成。btv基因组编码7种结构蛋白(vp1～vp7)和4种非结构蛋白(ns1、ns2、ns3/ns3a、ns4)；btv粒子具有双层衣壳，vp2和vp5组成外层衣壳，内层衣壳由vp3和vp7组成。btv脱去外层衣壳后形成病毒核心粒子，3种酶蛋白vp1、vp4、vp6位于核心粒子内部；其中非结构蛋白ns1蛋白由s6基因编码，是所有btv编码蛋白中表达量最高的蛋白，约占病毒总蛋白的25％。ns1蛋白在btv感染的细胞质中可以多聚体形式形成微管结构，这些微管的直径约为52nm、长约1000nm，这是btv感染细胞后最显著的特征之一，微管在btv感染细胞后2～4小时出现且存在于整个感染复制周期。ns1蛋白富含半胱氨酸，不同血清型btv的ns1蛋白中16个半胱氨酸都是保守的，表明ns1含有一个由二硫键连接的高度有序的结构；而且不同血清型btv的ns1蛋白的氨基酸序列高度保守，同源性99％以上。

3、目前关于btv定量检测方法有qrt-pcr、噬斑实验、免疫荧光、tcid50等方法。然而，由于btv已经发现29种血清型，每种血清型中不同病毒分离株的基因也有差异，因此，qrt-pcr法需要设计合成特异性引物和探针，成本较高，且可能会出现非特异性扩增。免疫荧光法需要制备或购买病毒特异性的抗体，易出现非特异性结合，而且不能对感染细胞中的活病毒进行实时定量和定位。噬斑实验和tcid50方法操作过程繁琐，技术要求比较高，增加了实验操作产生的误差，准确性和可重复性比较低。

4、近年来，对于病毒的可视化定量主要基于对编码荧光蛋白(fluorescentprotein，fp)的重组病毒进行定量，即通过基因工程的手段将表达gfp的基因与病毒蛋白基因融合，可以实现对病毒的特定蛋白进行荧光标记，然而这种标记方法在btv的应用存在很大局限性。btv的基因组由10个大小不等(0.8-3.9kb)的双链rna组成，其容纳外源基因的能力非常有限，由于荧光蛋白分子量通常在27ku～37ku，病毒大量表达荧光蛋白会影响标记病毒的感染力及复制能力，至今未见表达荧光蛋白的重组蓝舌病毒被拯救成功的报道。

5、本发明意外发现在蓝舌病毒非结构蛋白ns1的第156位和/或第493位氨基酸后插入四半胱氨酸(tetracysteine，tc)标签，且可以被拯救成功，构建获得的重组蓝舌病毒btv-1s6-156tc或btv-1s6-493tc与野生型蓝舌病毒的生物学特性没有明显区别，并且表达tc标签的重组蓝舌病毒能被双砷染料(reash)染色，tc标记的ns1蛋白可显示荧光，可用于btv感染的可视化定量检测以及ns1蛋白的定位和示踪研究。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明意外发现在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的第156位氨基酸或493位氨基酸后插入tc标签，成功构建获得了重组蓝舌病毒btv-1s6-156tc和btv-1s6-493tc；所述重组蓝舌病毒与野生型蓝舌病毒的生物学特性没有明显区别，并且表达tc标签的重组蓝舌病毒能被双砷染料(reash或flash)染色，tc标记的ns1蛋白可显示荧光，可用于btv感染的可视化定量检测和ns1蛋白的定位和示踪研究。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种用于荧光染色的重组蓝舌病毒，所述重组蓝舌病毒为在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的第156位氨基酸或493位氨基酸后插入tc标签获得。

3、优选地，所述tc标签为一个由四个半胱氨酸组成的发夹结构，其氨基酸序列为ccpgcc。

4、优选地，所述在野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。

5、优选地，所述在野生型蓝舌病毒为btv-1(gs/11)。

6、第二方面，本发明提供了一种重组蓝舌病毒的构建方法，所述方法为：通过基因工程手段在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的第156位氨基酸或493位氨基酸后插入tc标签获得重组蓝舌病毒。

7、优选地，所述方法包括以下步骤：

8、(1)在野生型蓝舌病毒s6基因cds序列的第468位碱基后或第1479位碱基后插入tc标签的基因序列，构建获得含有tc标签的蓝舌病毒s6基因转录质粒；体外转录生成含有tc标签的s6 mrna；

9、(2)分别构建野生型蓝舌病毒基因s1-s5、s7-s10的转录质粒，体外转录成mrna转录本；

10、(3)将步骤(1)所述含有tc标签的s6 mrna以及步骤(2)所述的mrna转录本共转染细胞，筛选获得重组蓝舌病毒。

11、优选地，所述步骤(1)中含有tc标签的蓝舌病毒s6基因转录质粒的构建方法为：

12、以野生型蓝舌病毒s6基因为模板，通过pcr基因定点突变技术在野生型蓝舌病毒s6基因cds序列的第468位碱基后和/或第1479位碱基后插入tc标签的基因序列，构建获得含有tc标签的蓝舌病毒s6基因转录质粒；所述tc标签的基因序列如seq id no.2所示。

13、优选地，所述在野生型蓝舌病毒为蓝舌病毒血清1型。

14、优选地，所述在野生型蓝舌病毒为btv-1(gs/11)。

15、优选地，所述s6基因cds序列位于s6基因全长的第35-1693位碱基处。

16、优选地，所述步骤(3)中的细胞为bhk-21细胞。

17、第三方面，本发明提供了一种上述第二方面所述方法构建获得的重组蓝舌病毒。

18、第四方面，本发明提供了上述第一方面或第三方面所述的重组蓝舌病毒具有如下任一所述的用途：

19、(1)在蓝舌病毒可视化定量检测中的应用；

20、(2)在蓝舌病毒ns1蛋白动态表达、定位和示踪研究中的应用。

21、本发明的有益效果是：(1)本发明意外发现只有在野生型蓝舌病毒非结构蛋白ns1的第156或第493位氨基酸后插入tc标签，才能拯救获得的重组蓝舌病毒，且重组病毒btv-1s6-156tc和btv-1s6-493tc均能被双砷染料(reash)染色，tc标记的ns1蛋白可显示荧光，可用于btv的可视化定量检测；(2)而且所述重组蓝舌病毒不影响原有野生型蓝舌病毒ns1蛋白的结构和功能；(3)重组蓝舌病毒还可以应用于ns1蛋白在细胞中的动态表达、定位和示踪研究，为深入揭示btv复杂的感染致病机制提供研究工具和技术平台。