一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法

本发明属于生物发酵，具体涉及一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法。

背景技术：

1、王浆酸(10-hda)是一种既含有双键又含有不饱和键的中链脂肪酸衍生物，分子式为c10h18o3。相对分子质量为186.25，熔点为64℃，迄今为止，王浆酸在自然界中仅存在蜂王浆中，含量仅为1.4%-2.4 %。反式-2-癸烯酸是生物合成王浆酸途径中的重要的中间体，因此，反式-2-癸烯酸的生物合成将为未来10-hda 的生物合成奠定基础。反式-2-癸烯酸除了可以用于合成王浆酸外，也是合成重要药物的化学中间体，还可作为配体来合成所需要的各向异性的纳米晶材料，除以上方面的用途，反式-2-癸烯酸还可被用来制作香料和香精等。因此，反式-2-癸烯酸作为中间产物或者最终产物都具有重要功能，具有极大的商业价值。

2、目前通过化学法合成反式-2-癸烯酸的方式是以辛醛和丙二酸或辛醛和二溴乙酸为原料反应，并经有机溶剂萃取得到。但是在利用各种不同原材料通过化学合成法合成目标物质的时候，普遍存在着对环境污染严重、反应可控程度低、安全保障系数低等缺点。所以，与传统方法相比，生物催化合成目标物质的方法因其具有安全性高、专一性强以及对环境污染性小等一系列优点引起了人们的广泛关注。目前生物合成王浆酸的瓶颈问题，就是底物癸酸和脂肪酸产物对发酵菌株具有一定的抑制作用，产量很难提高。

3、当前的基因编辑技术，其定向打靶都依赖于dna序列特异性结合蛋白模块的合成，这一步骤繁琐费时，实验周期长，基因编辑效率较低。

4、中国专利文献cn114958700a（申请号：202210510742.3）公开了一种大肠杆菌工程菌及应用，该专利文献敲除的基因为fadb基因、fadr基因、fadj基因，使用了red重组法敲除基因；中国专利文献cn110684794a（申请号：201911038194.3）公开了一种以脂肪酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备α、β不饱和脂肪酸的方法，该专利文献的方法通过过表达fade、fadd和ydii基因，同时敲除fadr和fadb基因阻断了β氧化的影响和细胞调控子的调控，优化反-2-癸烯酸表达途径；中国专利文献cn109402182a（申请号：201811126048.1）公开了一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，该专利文献构建了含有重组质粒pet-28a-ydii的大肠杆菌，并制备静息细胞实现了10-羟基-2-癸烯酸的大量生物合成；中国专利文献cn113106109b（申请号：202110211118.9）公开一种突变酶cyp153a m228l及以癸酸为原料两步法生物合成10-羟基-2-癸烯酸的方法，该专利通过改造cyp153a蛋白，构建了10-羟基-2-癸烯酸合成途径。现有专利文献公开的技术方案和技术效果与本发明明显不同。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法。

2、本发明的目的在于提供一株能够高产反式-2-癸烯酸的工程菌株及其应用。

3、本发明的技术方案如下：

4、一种构建高产反式-2-癸烯酸工程菌株的方法，包括如下步骤：

5、（1）将大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、j中的 aas基因利用crispr/cas9技术进行基因敲除，所述 aas基因的核苷酸序列如seq id no.15所示，得到大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aas；

6、（2）将步骤（1）中的大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aas作为出发菌株，继续将其中的 ftsq基因利用crispr/cas9技术进行基因敲除，所述 ftsq基因的核苷酸序列如seqid no.16所示，敲除完成后进行质粒消除，得到大肠杆菌工程菌bl21δfadb、r、jδ aasδ ftsq；

7、（3）将步骤（2）获得的大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aasδ ftsq利用转化法转入重组质粒pcdfduet-1-mamacs-ppfade、重组质粒pet28a-sumo-ctydii，得到大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aasδ ftsq-mei。

8、根据本发明优选的，步骤（1）、步骤（2）中，利用crispr/cas9技术进行基因敲除的方法包括如下：

9、①通过网站crisprrgen tools (rgenome.net)设计sgrna中含有20个碱基的基因；

10、该段基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

11、②设计引物，以原始大肠杆菌bl21的基因组为模板pcr扩增目的基因 aas的上游、下游

12、同源臂；

13、 aas基因上游同源臂的上游引物的核酸序列如seqid no.2所示，下游引物的核酸序列如seqid no.3所示，下游同源臂的上游引物的核酸序列如seqid no.4所示，下游引物的核酸序列如seqid no.5所示；

14、③利用overlap pcr将之前制备好的具有同源片段的上、下游同源臂连接形成donordna- aas线性片段；

15、④构建表达sgrna的质粒

16、确定对应的n20序列，上游引物的核酸序列如seq id no.6所示，下游引物的核酸序列如seq id no.7所示；以ptargetf质粒作为模板反向pcr扩增ptargetf- n20/aas线性片段，并利用试剂盒进行回收纯化，得到携带有目的基因n20序列的ptargetf- n20/aas线性基因片段；

17、将ptargetf- n20/aas线性基因片段化转进dh5α感受态细胞中完成环化，制得ptargetf- n20/aas质粒，并使用试剂进行质粒提取；

18、⑤将大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、j制成感受态，转化pcas9质粒，随后将含pcas9质粒的大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、j细胞制备成电转感受态；

19、⑥重组sgrna质粒与donor dna共转化：将制备的ptargetf- n20/aas质粒与donordna- aas转化入含pcas9质粒的大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、j感受态细胞，筛选阳性克隆菌株；

20、⑦消除ptargetf质粒，消除后得到大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aas，将其制成电转感受态细胞，再进行基因ftsq敲除操作，操作方法与所述步骤相同；最后消除cas9质粒，得到大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aasδ ftsq；

21、 ftsq基因的敲除过程中，设计的sgrna中n20基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；上游同源臂的上游引物的核酸序列如seqid no.9所示，下游引物的核酸序列如seqidn0.10所示；下游同源臂的上游引物的核酸序列如seqid no.11所示，下游引物的核酸序列如seqid no.12所示；表达sgrna的质粒中，上游引物的核酸序列如seq id no.13所示，下游引物的核酸序列如seq id no.14所示。

22、上述大肠杆菌工程菌bl21 δfadb、r、jδ aasδ ftsq-mei在生产反式-2-癸烯酸中的应用。

23、一种高产反式-2-癸烯酸的方法，包括如下步骤：

24、将上述大肠杆菌工程菌bl21δfadb、r、jδ aasδ ftsq-mei进行培养，当菌体量od600=0.8-1.2时，按体积分数5-10%接种至发酵培养基，培养至od600=0.8-1.2，加入终浓度为0.5-5 g/l的乳糖诱导，诱导条件为28-30 ℃，150-500 r/min，2-2.5h，得到发酵培养物，然后流加癸酸到发酵培养物中，进行全细胞催化，制得反式-2-癸烯酸。

25、根据本发明优选的，所述方法中，大肠杆菌工程菌bl21δfadb、r、jδ aasδ ftsq- mei接入lb液体培养基中，在35-37℃培养至菌液od600为0.8-1.2。

26、根据本发明优选的，所述方法中，诱导条件为将培养的菌液降温至30℃后，再加入终浓度为2-5g/l的乳糖，150-500 r/min培养2-2.5h。

27、根据本发明优选的，所述方法中，发酵培养基组份包括如下：

28、氯化钠8-12 g/l、蛋白胨8-12 g/l、酵母浸粉2-6 g/l，卡那霉素40-60μg/ml、氨苄霉素50-150μg/ml和链霉素20-60μg/ml，余量水，ph7.0-7.2。

29、进一步优选的，所述方法中，发酵培养基组份包括如下:

30、氯化钠10g/l、蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l，卡那霉素50μg/ml、氨苄霉素100μg/ml和链霉素40μg/ml，余量水，ph7.0-7.2。

31、根据本发明优选的，所述方法中，流加癸酸到发酵培养物中，在28-37℃条件下反应6-60h，制得反式-2-癸烯酸。

32、进一步优选的，所述方法中，流加的癸酸的终浓度为0.5-6g/l。

33、上述大肠杆菌工程菌bl21δfadb、r、j，及该菌的构建方法是现有技术，已在专利文献cn113106109a中公开，具体参照第[00197]-[0221]段，专利名称：一种突变酶cpy153m228l及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用，申请号：202110211118.9，公开日期2021.07.13。

34、上述重组质粒pcdfduet-1-mamacs-ppfade、重组质粒pet28a-sumo-ctydii，构建以及转化是现有技术，已在中国专利文献cn113106109a中公开，具体参照第[0048]-[0065]。

35、有益效果

36、1、本发明提供的大肠杆菌bl21 δfadb、r、jδ aasδ ftsq-mei工程菌株在发酵过程中，大大提高了对底物癸酸的耐受性，有效促进了癸酸合成反式-2-癸烯酸。

37、2、本发明提供的敲除大肠杆菌内目标基因的方法，敲除效率更高，操作更加便捷。