一种拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法。

背景技术：

1、细胞培养技术也叫细胞克隆技术，细胞培养用于细胞遗传学、生化和分子实验室的研究以及毒理学研究。

2、通过人为的控制细胞培养条件，能够研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响。细胞培养相较于动物实验耗资少、经济成本低，可大量培养，可利于生物制品的生产。目前已有非常多的细胞系建立成功，包括人类及模式动物的正常细胞、干细胞、肿瘤细胞和缺陷细胞等，但甲壳动物细胞培养依旧困难重重。迄今为止，还未见甲壳动物细胞培养技术应用的稳定方法的报道，更没有应用甲壳动物细胞进行细胞水平相关实验的报道。

3、甲壳动物细胞对外界环境生长条件非常敏感，目前，所能购买的商用培养基均为基础培养及和其他物种的特定培养基，仅使用基础培养基不足以满足甲壳动物细胞在体外的正常生存所需。在现有关于初步尝试甲壳动物细胞培养的报道中，无论是使用tc199、m199还是l-15及其他培养基都不能够使细胞长期保持活性，细胞增殖速率远远低于死亡率，更无法进行传代培养。因此，细胞培养技术在甲壳动物中一直未有突破性的进展。

4、精原干细胞(spermatogonial stem cells,sscs)是精子发生的基础，对生物的遗传信息传递至关重要。甲壳动物的精原干细胞都具有高度的自我更新和分化能力，在合适的培养条件下，具有形成拟胚体的能力，并具有分化为多种类型体细胞的潜能。然而，蟹类精原干细胞培养技术还不完善，尚未有关于蟹类sscs体外培养的相关报道。蟹类是否获得稳定精原干细胞系，蟹类sscs是否具有分化为不同类型体细胞还有待进一步证明。

5、探究蟹类sscs在种质资源保护和生殖细胞移植等领域的应用，获得稳定培养的精原干细胞系，对于深入研究甲壳动物营养代谢以及细胞生理等的分化潜能意义重大。本发明通过多层次、多元素、多方面条件的摸索，获得了甲壳动物拟穴青蟹精原干细胞的最佳培养条件，并设计培养基首次提供了一种体外培养青蟹精原干细胞系的方法，还提供了诱导精原干细胞分化为体细胞，以及诱导精原干细胞慢病毒感染以表达外源基因的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，突破甲壳动物细胞无法长期体外培养及传达的现状，首次在拟穴青蟹中提供了一种体外培养精原干细胞的方法，填补甲壳动物细胞实验技术的空白，提供了上述诱导精原干细胞分化为体细胞，以及诱导精原干细胞慢病毒感染以表达外源基因的方法。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法，包括如下步骤：

4、a、制备培养基，保存备用；

5、b、在离心管中加入所述培养基，备用；

6、c、在培养皿或孔板的培养孔中加入所述培养基，备用；

7、d、取组织放入所述离心管中，剪碎所述组织，再吹打所述组织，之后将所述离心管插入冰中静置，之后轻轻吸弃上清，吹打混匀细胞并计数，将一定数量细胞的悬液转移到所述培养皿或所述孔板的培养孔中；

8、e、将所述培养皿或所述孔板的培养孔移入培养箱中培养，之后沿所述培养皿或所述孔板的培养孔边缘缓慢吸弃上层所述培养基，加入适量相应培养液，勿使细胞漂起，移入所述培养箱中继续培养；

9、f、定时换液，换液时缓慢吸弃旧的所述培养基原液，加入新的所述培养基；

10、g、待原代细胞长满所述培养皿或所述孔板的培养孔底后，进行传代或进一步筛选。

11、优选的，步骤a中，所述培养基包括如下组分：dmem高糖培养基为基础培养基，添加胎牛血清、拟穴青蟹血清、青霉素-链霉素-两性霉素b混合抗生素、l-谷氨酸、非必要氨基酸、丙酮酸、碱性成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇；所述拟穴青蟹血清的制备方法为：在拟穴青蟹身上抽血，与抗凝剂混匀、离心，收集上清，过滤除菌后获得所述拟穴青蟹血清。

12、加入一定量的拟穴青蟹血清可缓解细胞离体培养的不适应性，并能够为拟穴青蟹精原干细胞在培养过程中提供其他动物血清不具备的营养物质，使拟穴青蟹精原干细胞在体外的生长状态保持稳定。

13、优选的，步骤a中，所述培养基的配置为：每升基础培养基中添加200ml胎牛血清、20ml拟穴青蟹血清、10ml青霉素-链霉素-两性霉素b混合抗生素、2ml l-谷氨酸、4ml非必要氨基酸、2ml丙酮酸钠、200ng碱性成纤维细胞生长因子和10mlβ-巯基乙醇；所述拟穴青蟹血清的制备方法为：在拟穴青蟹成蟹关节膜处抽血，之后与等体积的所述抗凝剂混匀，4℃下2000×g离心20min，

14、收集上清，使用0.22μm滤膜过滤除菌，获得所述拟穴青蟹血清。

15、优选的，步骤a中，所述培养基制备完成后，低温保存备用；步骤b中，所述离心管插入冰中备用；步骤d中，使用眼科剪剪碎所述组织，再使用移液枪吹打所述组织，之后将所述离心管插入冰中静置1h，所述悬液中细胞数为1×108个/毫升；步骤e中，将所述培养皿或所述孔板的培养孔移入培养箱中以26～29℃培养24h，吸弃上层所述培养基并加入所述培养液继续培养；步骤f中，定时换液频率为1～2天换液一次；步骤g中，每次细胞铺满单层按1：2的比例连续传代。

16、优选的，步骤a中，所述培养基制备完成后，4℃保存备用；步骤d中，所述眼科剪使用前浸泡到75％乙醇放入超净台中，紫外灭菌30min，之后取出放超净台里晾干；步骤e中，培养温度为28℃。

17、一种如上所述拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法的应用，用于将拟穴青蟹精原干细胞分化为拟穴青蟹体细胞。

18、优选的，所述体细胞包括骨细胞、脂肪细胞中的一种或多种。

19、优选的，将拟穴青蟹精原干细胞分化为骨细胞的诱导条件为：在所述培养基中加入10mmol/lβ-磷酸甘油钠、50mg/l维生素c和10-5mmol/l地塞米松混合为成骨诱导培养基，将细胞置于28℃培养箱诱导培养，每3天更换一次所述骨诱导培养基，连续诱导9d；将拟穴青蟹精原干细胞分化为脂肪细胞的诱导条件为：在所述培养基中加入0.05mmol/l 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.2mmol/l吲哚美辛、10mg/l胰岛素和10-3mmol/l地塞米松作为成脂诱导培养基，将细胞置于28℃培养箱诱导细胞产生脂滴，诱导培养24h后，用加入了10mg/l胰岛素的所述培养基维持细胞现有状态及脂滴大小48h，再换所述成脂诱导培养基继续诱导脂滴增大，如此反复3个周期。

20、一种如上所述拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法的应用，用于筛选培育特定稳定表达的细胞。

21、拟穴青蟹精原干细胞能够稳定表达特定的基因，可以作为拟穴青蟹体外细胞生物学研究的优良载体。

22、优选的，所述特定稳定表达的细胞的筛选培育方式为：将100moi含有绿色荧光蛋白(gfp)质粒的慢病毒感染1×105个/ml拟穴青蟹精原干细胞，48h后通过荧光显微镜检测gfp阳性细胞在体外转染精原干细胞的效率，8天后，不表达绿色荧光蛋白(gfp)的细胞基本被杀死，存活细胞均稳定表达蛋白，且可以继续培养25天，获得所述特定稳定表达的细胞。

23、与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：

24、本发明建立了一种拟穴青蟹精原干细胞体外培养方法。其中，拟穴青蟹精原干细胞可以培养395天以上，能够连续培养15-20代；通过本发明方法所获得的拟穴青蟹精原干细胞，具有干性和增殖活性；拟穴青蟹精原干细胞经过诱导可以分化为体细胞，例如骨细胞，脂肪细胞。

25、以本发明方法培养的拟穴青蟹精巢细胞，经细胞形态学观察与鉴定，通过光学显微镜镜下进行形态学观察，并通过免疫细胞化学检测精原细胞特异性标记物，确定为拟穴青蟹精原干细胞。细胞表达干细胞标记分子和生殖细胞标记分子；表达具有nanog增殖活性和生殖细胞标记蛋白dazl；细胞周期分析具有二倍体和四倍体；冻存之后仍能复苏且仍存在增殖能力。

26、所得到的拟穴青蟹精原干细胞经慢病毒感染可以稳定表达gfp，并能够继续培养25天。

27、综上所述，本发明方法获得了一种连续传代的拟穴青蟹精原干细胞，具有干细胞性能，可分化为体细胞，能够作用良好的工具细胞。