一种胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌及其构建方法与应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、贻贝是一种常见的双壳类软体动物。由贻贝足丝腺分泌的的一类具有粘附性的蛋白称为贻贝足丝蛋白(musselfootprotein，mfp)。目前已经鉴定出6种足蛋白(mfp-1～mfp-6)。贻贝蛋白具有高强度和持久性的黏附能力，能够在水流的反复冲刷下维持贻贝的稳定。除此之外，贻贝蛋白还具有良好的生物相容性、无致敏性以及无毒性等优点，使得贻贝足丝蛋白在医药、电子器械、汽车与航天工业以及涂料等许多行业具有广阔的应用潜力。

2、传统的贻贝足蛋白提取方法是直接提取法，生产成本高、提取效率低。高昂的价格限制了对贻贝蛋白的研究与利用，因此人们开始借助基因工程技术获得mfps。在重组蛋白表达系统中，以原核生物和真核生物为宿主均有报道。常用的原核生物宿主主要为细菌(大肠杆菌)，真核生物宿主包括昆虫、酵母(酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母)和植物(烟草、菊苣)。mefp-1、mfp-5、mfp-3a、mcofp-1,-3等在原核宿主中实现表达；mefp-3、mefp-1、mcfp-3、mgfp-5等在真核宿主中实现表达。贻贝足蛋白尚未实现规模化生产，主要源于异源表达产率较低。而且大肠杆菌胞质内还原性环境不利于蛋白质二硫键的形成，使得具有生物活性的可溶性蛋白表达较少，多以包涵体形式表达。氧化性的周质空间为肽链的正确折叠提供了良好的环境，而且较少的蛋白水解酶使得产物不易降解。然而菌体的周质空间有限，容量巨大的发酵培养基可能是重组蛋白的最佳去处。但是由于大肠杆菌具有双层膜和复杂的周质空间，蛋白分泌需要跨越内膜和外膜两层膜，较革兰氏阳性细菌困难。

3、信号肽(signal peptide，sp)是一段位于目的蛋白n端，能够引导蛋白转移到周质空间的短肽链。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于膜表面的信号肽酶水解。在信号肽的协助下，新生多肽链从细胞质转入细胞周质空间，并在周质空间中进行折叠，最终被分泌到胞外。但是对于定位在胞内的蛋白在大肠杆菌重组表达时，即使给目的蛋白添加信号肽，也无法分泌到细胞外，因此需要辅以其他手段来帮助目的蛋白实现分泌。常见的手段有提高目的蛋白的输出能力(增强信号肽、强化转录调节因子、过表达转运rna等)，调节细胞膜通透性(外部破坏，关键酶敲除，脂类水解酶等)。

4、角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类和不溶性多聚体角质等。角质酶具有磷脂酶的水解活性,通过对大肠杆菌细胞膜磷脂成分的水解作用，从而提高细胞膜的通透性来实现目标蛋白的胞外分泌。表面活性剂能从外部溶解细胞膜中的脂类物质，增加细胞膜的通透性，有助于目的蛋白分泌到胞外，从而提高胞外分泌能力。

5、目前关于大肠表达体系的贻贝蛋白胞外分泌的研究未见报道。在之前的研究中发现可溶性的贻贝蛋白积累会对菌体产生毒性作用，因此实现可溶性贻贝蛋白的胞外分泌，避免产物胞内积累，减少菌体压力，简化下游纯化工艺，将具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌的构建方法。

3、本发明还要解决的技术问题是提供上述胞外分泌贻贝蛋白的的基因工程菌在发酵产贻贝蛋白中的应用。

4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

5、一种胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌，以e.coli bl21(de3)为表达宿主，在表达载体上依次插入信号肽基因，贻贝蛋白基因和角质酶基因，其中信号肽基因与贻贝蛋白基因进行融合表达后，再与角质酶基因共表达。

6、其中，所述的表达载体为pet-duet(购买于诺唯赞)。

7、其中，所述的信号肽为bla、ompc、mglb、ompa、dsba和pelb中的任意一种，其核酸序列如seq id no.3、5、7、9、11、13所示，对应的氨基酸序列如seq id no.4、6、8、10、12、14所示。

8、优选的信号肽为bla、ompc、mglb，最优选的信号肽为bla。

9、其中，所述的贻贝蛋白为mgfp-5，其核酸序列如seq id no.1所示，对应的氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、其中，所述的角质酶为角质酶tfu-0883，其核酸序列如seq id no.15所示，对应的氨基酸序列如seq id no.16所示。

11、本发明还提供了上述胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

12、(1)通过pcr将信号肽与贻贝蛋白基因片段进行连接，且信号肽位于贻贝蛋白n端，将连接后的片段导入质粒pet-duet的一个多克隆拷贝位点，获得导入信号肽与贻贝蛋白基因的质粒pet-duet；

13、(2)在步骤(1)获得的导入信号肽与贻贝蛋白基因的质粒pet-duet的另一个多克隆拷贝位点导入角质酶基因，获得重组质粒；

14、(3)将步骤(2)获得到的重组质粒导入e.coli bl21(de3)中进行表达得到重组大肠杆菌，即为可胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌。

15、上述胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌在发酵制备贻贝蛋白中的应用也在本发明所保护的范围之内。

16、其中，胞外分泌贻贝蛋白的基因工程菌在发酵制备贻贝蛋白中的应用，包括如下步骤：

17、(a)将权利要求1-5任意一项所述的基因工程菌经平板活化后接种至摇瓶中进行培养，制备种子液；

18、(b)将步骤(a)中获得的种子液按1-10％v/v的接种量接种至液体培养基中进行发酵培养，收集发酵上清液及菌体。

19、其中，步骤(a)中，所述的培养，其培养条件为：35-40℃，180-220rpm培养8-12h。

20、优选的培养条件为：37℃，200rpm振荡过夜培养10h。

21、其中，步骤(a)中，所述的lb培养基配方为：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、10g/l氯化钠和25-50μg/ml氨苄青霉素。

22、其中，步骤(b)中，所述的种子液1-10％v/v的接种量，优选的接种量为10％。

23、其中，步骤(b)中，所述的发酵培养，其发酵条件为：35-40℃，180-220rpm培养，至od600达到2-3时加入诱导剂，诱导剂终浓度0.1-1mm，继续培养6-10h。

24、具体的，所述的诱导剂为iptg。

25、优选的发酵条件为：37℃，200rpm培养至od600为2-3，添加iptg至终浓度为1mm，在37℃，200rpm继续培养6h。

26、其中，步骤(b)中，所述的液体培养基为：10-20g/l蛋白胨、5-10g/l酵母粉、10-20g/l氯化钠，25-50μg/ml氨苄青霉素和1-5g/l表面活性剂。

27、具体的，所述的表面活性剂为span-80、tween-80、tween-60、trition-x100、sds、二甲基亚砜中的任意一种。优选的表面活性剂为trition-x100。

28、其中，步骤(b)中，所述的胞外分泌的贻贝蛋白，其浓度可达20-40mg/l。

29、优选的胞外分泌的贻贝蛋白浓度达35-40mg/l。

30、有益效果：

31、(1)本研究首先实现了贻贝蛋白在大肠杆菌中的表达，并通过与信号肽融合并且与角质酶共表达，最终使贻贝蛋白实现了胞外分泌。此外通过优化发酵培养基，使胞外分泌的产量提高，有助于工业化生产。本发明制备的贻贝蛋白可在医药、器械、涂层等领域得到广泛应用。

32、(2)本发明建立了一个实现贻贝蛋白胞外分泌的方法，使得贻贝蛋白可以在发酵培养基中被直接提取，避免了破碎菌体操作，优化了工艺，并且分泌的都是具有生物活性的可溶性蛋白。