一种特基拉芽孢杆菌、微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一种特基拉芽孢杆菌、微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猕猴桃(actinidia chinensis)，又称为奇异果，属于猕猴桃科(actinidiaceae)猕猴桃属(actinidia lindl.)，是一类营养丰富和较高经济价值的藤本类果树。我国是世界上猕猴桃产业中的最大生产国和消费国，其中主要的猕猴桃栽培区在四川、陕西、贵州、广西等。然而在栽培产业中，细菌性溃疡病病害是猕猴桃最严重的病害之一，这是一种世界范围内的病害，该病害能在短时间内毁灭受其感染的果园。早在1996年我国把猕猴桃细菌性溃疡病列为猕猴桃植物病害检疫对象当中，这种病害主要由丁香假单胞猕猴桃致病变种(pectobacterium syringae pv.actinidia)引起。近几年，出现了一种主要由胡萝卜软腐果胶杆菌猕猴桃致病变种(pectobacterium actinidiae)引起的猕猴桃溃疡病，被称为猕猴桃夏季溃疡病，其发病症状与由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种引起的溃疡病十分相似，发病多从叶片、枝条分叉、伤口等处开始，病斑初期呈水渍状，后扩大，颜色加深，用刀划开皮层可见韧皮部变褐和腐烂。植株叶片发病首先呈现水浸状褐绿色小点，随后扩展成2-3mm褐色或暗褐色不规则形病斑，许多小斑点扩展成为多角形大斑。由pectobacteriumactinidiae引起的猕猴桃夏季溃疡病于2012年在韩国被首次报道，随后，在我国四川、江西和浙江都有报道。目前对于由pseudomonas syringae pv.actinidiae导致的猕猴桃溃疡病防治还是遵循“预防为主，综合防治”的策略方针，运用抗病品种的选育、农业防治、化学防治和生物防治来综合防治该病害。而对于由pectobacterium actinidiae导致的溃疡病目前还未有报道。

2、随着化学农药的使用带来严重污染、病菌的抗药性和抗病品种选育难等问题，很多研究者将防控该溃疡病菌的方法着眼于生物防治上。目前最好的生物防治措施还是筛选对猕猴桃溃疡病具有拮抗作用的生物防治菌株，其中包括拮抗放线菌、拮抗细菌、内生真菌等。在拮抗放线菌的筛选上，链霉菌属的菌株往往具有良好的防效。朱海云采用喷雾法和注干法对生防菌株进行筛选，得到了链霉菌属的肉桂地链霉菌m109菌株对溃疡病的防治显著。宋晓斌从56株放线菌中筛选到一株链霉菌属的菌株，其对猕猴桃溃疡病具有良好的防效。在拮抗细菌的筛选工作上，崔丽红等人把分离到的根际内生菌进行拮抗活性试验，发现菌株jdg6，jdg16，jdg23均表现出较强的拮抗活性。郭睿文在四川和湖南的猕猴桃果园健康植株与病株上采集样品，从这些样品上分离菌株，经过鉴定以及抗菌实验后发现6株有效的生防菌株，其中3株属于假单孢菌属(pseudomonas sp.)，另外3株属于梭形芽孢杆菌属(lysinibacillus sp.)。邵宝林等从土壤中分离得到了25株芽孢杆菌，其中一组命名为b2的蜡样芽孢杆菌防治效果最强。在拮抗真菌筛选上，燕金宜等人通过筛选得到一株黑孢菌属(nigrospora sp.)的内生菌株，命名为j2，对猕猴桃溃疡病具有良好的防治效果。

3、目前，我国对于猕猴桃溃疡病的生物防治还处在初步探索阶段，可以运用到试剂生产中的微生物源菌剂还比较稀缺，但因为生物防治有着安全无害，一旦生物防治菌株在植株上定殖，能长期控制病原菌的生长，而且对环境友好、无农药残留、不会产生抗药性等诸多优点，其具有良好的发展前景，也越来越受到大家的欢迎。鉴于此，本发明提供一种特基拉芽孢杆菌、微生物菌剂及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种特基拉芽孢杆菌、微生物菌剂及其制备方法和应用。通过从发病的猕猴桃叶片中分离得到一株对胡萝卜软腐果胶杆菌猕猴桃致病变种(pectobacterium actinidiae)有拮抗作用的特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)yp131，将特基拉芽孢杆菌yp131制备成微生物菌剂作用于猕猴桃溃疡病的防治，可防止或减轻病原菌侵染造成的猕猴桃病害影响，具有可观的生产应用前景。

2、本发明为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种特基拉芽孢杆菌，特基拉芽孢杆菌(bacillus tequilensis)yp131，其保藏编号为：cgmcc no.26340，于2022年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3、本发明的有益效果是：(1)本发明的一株特基拉芽孢杆菌yp131，分类命名为bacillus tequilensis，于2022年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.26340。本发明是专门针对猕猴桃夏季溃疡病开发的微生物菌剂，避免了因化学农药的使用所带来的一系列问题，不易产生抗性，对环境安全，无公害，无残留，专一性强，活性高，生产成本低，制备工艺简单。因而有利于猕猴桃的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留。

4、(2)实验结果表明：本发明的特基拉芽孢杆菌yp131(cgmcc no.26340)微生物菌剂能显著降低猕猴桃夏季溃疡病的发生。利用特基拉芽孢杆菌yp131微生物菌剂进行喷雾处理，对猕猴桃夏季溃疡病的防效为75.01％。

5、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

6、第二个目的是提供一种微生物菌剂，包含上述中所述的特基拉芽孢杆菌yp131。

7、进一步，所述微生物菌剂中特基拉芽孢杆菌yp131浓度为1×107～1×108cfu/ml。

8、进一步，所述微生物菌剂中特基拉芽孢杆菌yp131浓度为3×107～7×107cfu/ml。

9、第三个目的是提供微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

10、步骤1，制备种子菌液：将特基拉芽孢杆菌yp131接种到lb培养液中，在28±3℃，振荡培养至少10h，取样测在600nm处的od值，直到当od值为0.8±0.05时结束培养，得到的混合菌液为种子菌液；

11、步骤2，发酵培养：将步骤1中的种子菌液以1:(300-700)体积比接种至lb发酵培养液中发酵培养，在28±3℃，振荡培养10～14h，离心，取沉淀用灭菌水进行稀释得到菌悬液，且使得到菌悬液在600nm处的od值为0.2，即制得微生物菌剂。

12、说明利用所述的防治猕猴桃夏季溃疡病的特基拉芽孢杆菌yp131微生物菌剂的制备并不限于以上方法。凡是能够大量培养yp131，且保持其生防活性的方法均可用于制备本发明请求保护的微生物菌剂。

13、进一步，包括如下步骤：

14、步骤1，制备种子菌液：将特基拉芽孢杆菌yp131接种到lb培养液中，在28±3℃，100～300rpm振荡培养至少10h，每隔1～3h在超净工作台中取样，测在600nm处的od值，直到当od值为0.8±0.05时结束培养，得到的混合菌液为种子菌液；

15、步骤2，发酵培养：将步骤1中的种子菌液以1:(400～600)体积比接种至lb发酵培养液中发酵培养，在28±3℃，100～300rpm振荡培养10～14h，离心，取沉淀用灭菌水进行稀释得到菌悬液，且使菌悬液在600nm处的od值为0.2，即制得微生物菌剂。

16、进一步，步骤2中将步骤1中的种子菌液以1:500体积比接种至lb发酵培养液中发酵培养。

17、进一步，步骤2中离心步骤具体为在4000～6000rpm的条件下离心20～30min。

18、第四个目的是提供微生物菌剂的应用，将如上述所述微生物菌剂用于拮抗胡萝卜软腐果胶杆菌。

19、进一步，将如上述所述微生物菌剂用于预防和/或治疗由胡萝卜软腐果胶杆菌猕猴桃致病变种引起溃疡病。