具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种乳蛋白多肽的制备技术，尤其是涉及一种具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、血管内皮细胞是衬附在血管内壁的一层选择性生物半透膜屏障，具有多种生物学功能，主要包括维持血管张力、血管生成、止血、以及为机体提供一个抗氧化、抗炎和抗血栓形成的界面。在不良生活习惯和亚健康状态的共同作用，会导致血管内皮细胞损伤，进而引发炎症增加、氧化压力增大、白细胞/血小板向损伤内皮粘附、代谢紊乱和内皮衰老等；而内皮功能障碍又会反过来导致加速心血管疾病与其它泛血管疾病、代谢性疾病乃至急性感染性疾病的发生发展。鉴于血管内皮细胞的重要作用，近年来中国科学家提出了“血管内皮细胞稳态失衡是泛血管疾病进展的关键机制，改善各种病因与理化因素所致血管功能与结构紊乱的核心在于维护内皮细胞功能”的新理论。因此，维护血管内皮细胞功能和修复血管内皮细胞损伤对维持人体健康具有重要意义。

2、临床上针对内皮细胞损伤和内皮功能障碍的治疗药物主要分为几类，分别是降脂类药物、抗高血压药物、抗糖尿病药物、抗炎药和enos增强剂和抗氧化剂等，但是这类临床药物均存在一定的毒副作用，主要针对病患的治疗，而无法满足健康人群“未病先防”的保健需求。生物活性多肽是来源于可食用蛋白质剪切、一般含有2-10个氨基酸的一类化合物，具有极高的使用安全性。同时，生物活性肽结构丰富、数量庞大，兼具多种功能活性。同时，相同的蛋白质原料，使用不同的酶解工艺对特定/非特定位置进行剪切，也会产生不同的功能活性，是功能食品开发的重要原料之一。

3、乳源性的蛋白质是一种常用来制备活性多肽的蛋白质原料，经不同的蛋白酶及其组合的水解工艺搭配，可以产生不同的多肽谱，具有不同的生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖以及免疫调节等。

4、现有专利文献cn100398661c公开了具有ace抑制或降血压作用的酪蛋白水解物制备过程，以酪蛋白为原料，使用来源于米曲霉胞外酶酶组进行直接酶解制备，并证明其具有体外ace酶活抑制和体内降血压功能。专利文献cn115305270a公开了具有解酒护肝修复血管作用的寡肽及其制备方法，其利用乙醇在斑马鱼中建立血管损伤模型，该模型主要监测心率和血流速度。专利文献cn110511274b公开了一种利用酪蛋白为原料，原料预处理结合两步酶解法的降糖肽的制备方法。专利文献cn107964034b公开了一种经超声预处理和蛋白酶酶解的活性肽制备方法，并通过模拟胃肠道消化和单层细胞模型最终筛选获得具有ace抑制活性的多肽。但是，目前国内外相关文献均没有公开关于酪蛋白活性多肽的预处理、制备和后处理方法，并揭示其对血管内皮细胞损伤具有显著修复功能。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够显著的修复血管内皮细胞损伤的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽及其制备方法和应用。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽，包括mp、ip、rp、ep、yp、ipp、vpp、spp和fpp。

3、上述具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)将酪蛋白加入水中得到质量浓度为10-20％的酪蛋白溶液，将酪蛋白溶液置于70-90℃水浴中，处理10-30min，得到预处理液；

5、(2)将预处理液冷却至室温，调节预处理液的ph值至5-8后，加入酪蛋白质量0.1-10％的来源于米曲霉的胞外酶组，在40-60℃下，酶解反应2-8h后，经灭酶处理得到酶解液；

6、(3)将酶解液冷却至室温，加入酶解液质量0.5-5％的硅藻土，室温下搅拌10-60min后，对酶解液进行离心，取上清液；

7、(4)将上清液高压灭菌、真空浓缩和喷雾干燥得到乳蛋白多肽。

8、优选的，步骤(1)中所述的加热温度为80℃，加热时间为15-20min。

9、优选的，步骤(2)具体为：将预处理液冷却至室温，调节预处理液的ph值至6-7后，加入酪蛋白质量1-3％的来源于米曲霉的胞外酶组，在50℃下，酶解反应3-4h后，加热到100℃灭酶处理20min，得到酶解液。

10、优选的，步骤(3)中所述的硅藻土的添加量为4％，硅藻土的吸附处理时间为30min。

11、优选的，步骤(3)中所述的离心处理转速2000-4000rpm，时间为20min，温度为室温。

12、优选的，步骤(4)中所述的高压灭菌具体为利用121℃处理时间20min进行高温高压灭菌。

13、优选的，步骤(4)中所述的喷雾干燥进口温度为200℃，喷雾干燥的出口温度为95℃。

14、上述乳蛋白多肽在制备血管内皮细胞损伤修复剂方面的应用。

15、上述乳蛋白多肽在靶向增加enos基因在mrna水平表达方面的应用。

16、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽及其制备方法和应用，活性多肽具有显著的修复血管内皮细胞损伤的功能，无毒无依赖、可长期食用，可以作为功能原料添加入功能性食品；该制备方法通过原料加热预处理的方式改变酪蛋白的结构，加热预处理可以使得酪蛋白结构松散、活性基团暴露，有利于酶组充分酶解，释放具有血管上皮细胞损伤修复功能的多肽片段；随后通过酶组一步法酶解的形式完成酪蛋白的水解切割和活性多肽释放，最后通过硅藻土后处理的方式，吸附长链活性肽杂质，而本发明的功能多肽往往是短肽，硅藻土对其吸附能力较弱，同时这些长链多肽中会提供臭味和苦味等不良风味，影响酶解液的澄清度。通过这种差异化处理，可以在保持酶解液血管上皮细胞损伤修复活性的前提上，改善酶解液风味和外观，最终获得澄清、无臭味和苦味等不良风味的乳蛋白肽溶液。具体优先如下：

17、1、本发明采用的制备方法以价格低廉的酪蛋白为原料开发生物活性肽，可满足市场需要的大规模工业化生产；

18、2、在酶解之前通过加热预处理改变酪蛋白结构，可以提高酶解效率，增加具有血管内皮细胞损伤修复功能的多肽释放，减少蛋白酶用量；

19、3、本发明可以通过一步酶解法制备ipp+vpp+spp+fpp含量为1.61％、mp+ip+rp+ep+yp含量为5.67％的酪蛋白水解物，并利用硅藻土后处理吸附杂质、澄清酶解液和改善风味，小幅提升活性多肽含量，简便快速地获得可添加入食品和保健品的、具有血管内皮细胞损伤修复功能的活性多肽，具备市场应用前景；

20、4、本发明制备的酪蛋白水解物通过斑马鱼功能实验，证明具有血管内皮细胞损伤修复功能，具体表现在增大普纳替尼处理血管内皮细胞损伤斑马鱼的血管直径和no荧光染色强度。

技术特征：

1.一种具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽，其特征在于：包括mp、ip、rp、ep、yp、ipp、vpp、spp和fpp。

2.一种权利要求1所述的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的加热温度为80℃，加热时间为15-20min。

4.根据权利要求2所述的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，其特征在于步骤(2)具体为：将预处理液冷却至室温，调节预处理液的ph值至6-7后，加入酪蛋白质量1-3％的来源于米曲霉的胞外酶组，在50℃下，酶解反应3-4h后，加热到100℃灭酶处理20min，得到酶解液。

5.根据权利要求2所述的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的硅藻土的添加量为4％，硅藻土的吸附处理时间为30min，所述的离心处理转速2000-4000rpm，时间为20min，温度为室温。

6.根据权利要求2所述的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的高压灭菌具体为利用121℃处理时间20min进行高温高压灭菌。

7.根据权利要求2所述的具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的喷雾干燥进口温度为200℃，喷雾干燥的出口温度为95℃。

8.一种权利要求1所述的乳蛋白多肽在制备血管内皮细胞损伤修复剂方面的应用。

9.一种权利要求1所述的乳蛋白多肽在靶向增加enos基因在mrna水平表达方面的应用。

技术总结
本发明公开了具有血管内皮损伤保护功能的乳蛋白多肽及其制备方法和应用，特点是包括MP、IP、RP、EP、YP、IPP、VPP、SPP和FPP，其制备方法包括以下步骤：1)将10‑20wt％酪蛋白溶液置于70‑90℃水浴中，处理10‑30min，得到预处理液；2)将预处理液冷却至室温，调节预处理液的pH值至5‑8后，加入酪蛋白质量0.1‑10％的来源于米曲霉的胞外酶组进行酶解反应得到酶解液；3)在酶解液中加入酶解液质量0.5‑5％的硅藻土搅拌10‑60min后对酶解液进行离心，取上清液；4)将上清液高压灭菌、真空浓缩和喷雾干燥得到乳蛋白多肽；优点是提取效率高，能够显著的修复血管内皮细胞损伤。

技术研发人员：周海滨,周凯,芦晨阳,季亚飞,姚德中,刘亚津,杨小宏,俞伟
受保护的技术使用者：宁波立华制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12