重组酯酶突变体、工程菌及在合成(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用

(一)本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种重组酯酶突变体、编码基因、重组载体、重组基因工程菌以及在生产手性3-环己烯-1-甲酸中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、酯酶(esterases，ec3.1.1.x)是一类催化酯键水解和合成的酶的总称，催化酯键合成时把醇的羟基与酸的羧基脱水缩合，得到酯类化合物，催化酯键水解时产生相应的脂肪酸和甘油。酯酶在动物、植物和微生物当中普遍存在，在化工、食品、制药等行业广泛应用。

2、(s)-3-环己烯-1-甲酸作为手性化合物是一种重要的化学试剂和有机中间体，广泛应用于医药、化工等多个领域。(s)-3-环己烯-1-甲酸是凝血因子xa抑制剂依度沙班(edoxaban，商品名：savaysa)合成的重要手性中间体。与同类型凝血因子xa抑制剂药物如阿哌沙班、利伐沙班相比，依度沙班具有出血风险小、肾脏负担小、使用安全等突出优点，市场前景广阔。而(s)-3-环己烯-1-甲酸作为该药物的关键中间体，其高效制备技术成为研究热点。目前工业上采用非对映异构体拆分技术制备(s)-3-环己烯-1-甲酸，以手性苯乙胺作为手性拆分剂，将外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯与苯乙胺形成的非对映体异构体，基于这对非对映体异构体在丙酮中溶解度的差异来进行分离。经缓慢冷却重结晶6次后，最终(r)-3-环己烯-1-甲酸的得率为28.3％，(s)-3-环己烯-1-甲酸的得率为28.7％，两者的光学纯度均大于99％。但是该技术手性拆分剂价格昂贵，用量大，且操作复杂，收率较低，不符合绿色化学的要求，开发绿色高效的(s)-3-环己烯-1-甲酸制备技术成为依度沙班合成的重要研究领域。

3、采用酯酶催化外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯不对称拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸已经得到研究。商品化的猪肝酯酶可催化水解(r，s)-3-环己烯-1-甲酸甲酯制备手性3-环己烯-1-甲酸，(s)-3-环己烯-1-甲酸的转化率为41％，e.e.>99％，缺点是成本高、底物负荷低以及同工酶的干扰，这些动物源性蛋白的应用可能受到阻碍。王舰等利用含酯酶的acinetobacter sp 192全细胞作为催化剂，催化40g/l外消旋环己烯-1-甲酸甲酯的不对称拆分，反应5h，产物(r)-3-环己烯-1-甲酸的e.e.值为75％，收率为40.7％，缺点是功能酶含量低，微生物细胞负荷过大，生物催化剂成本高，受其他细胞内酶干扰，对映体选择性降低。wu等对来源于大肠杆菌的羧酸酯酶bioh进行分子改造，通过调整活性口袋的空间位阻作用、酶和底物间的芳香环作用以及氢键作用来调整其对映体选择性，显著提高酶的立体选择性，催化拆分制备s-3-环己烯-1-甲酸的产物e.e.值提升至79.9％，但缺点是立体选择性仍然不高，同时突变体活性降低。倪晔等利用来源于不动杆菌的酯酶，催化外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯的不对称拆分，底物浓度100-500mm(14-70g/l)，产物(s)-3-环己烯-1-甲酸产率>40％，e.e.s>99％，缺点是催化反应时间过长。

4、总体而言，目前报道的酯酶拆分生产(s)-3-环己烯-1-甲酸技术主要存在的问题是拆分过程中酯酶催化活力低，催化剂使用量大，反应时间长，酯酶稳定性差，底物耐受性差，现有酯酶尚不能达到规模化工业生产的要求。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种重组酯酶突变体、编码基因、工程菌以及在催化外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯(rac-chcm)对映选择性水解制备(s)-3-环己烯-1-甲酸甲酯((s)-chcm)、再在碱性条件下加热水解得到(s)-3-环己烯-1-甲酸((s)-chca)中的应用，所述重组酯酶突变体具有较高的催化活力，减少催化剂用量，缩短反应时间，且反应条件温和，催化效率与转化率明显提升，生产成本降低且对环境友好。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种高活力的重组酯酶突变体，所述重组酯酶突变体是将seq idno.1所示氨基酸序列第58位、63位、78位、240位、249位、253位、329位进行单突变或者组合突变获得的。

4、进一步，优选所述重组酯酶突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第58位谷氨酰胺突变为丙氨酸(q58a)；(2)第63位赖氨酸突变为丙氨酸(k63a)；(3)第78位苯丙氨酸突变为丙氨酸(f78a)；(4)第240位苯丙氨酸突变为丙氨酸(f240a)；(5)第249位赖氨酸突变为丙氨酸(l249a)；(6)第253位的天冬氨酸突变为丙氨酸(d253a)；(7)第329位的天冬酰胺突变为丙氨酸(n329a)；(8)第240位苯丙氨酸突变为丙氨酸，第253位的天冬氨酸突变为丙氨酸(f240a/d253a，核苷酸序列如seq id no.4所示，氨基酸序列如seqid no.3所示)。

5、更优选，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列第240位苯丙氨酸突变为丙氨酸；或者第240位苯丙氨酸突变为丙氨酸，第253位的天冬氨酸突变为丙氨酸。

6、本发明还提供一种所述重组酯酶突变体编码基因，含所述编码基因的重组载体以及重组载体构建的工程菌，所述表达载体为pet28a(+)，工程菌宿主为e.coli bl21(de3)。

7、本发明所述重组酯酶突变体是通过对野生型酯酶est13进行多个氨基酸的突变，提高其对外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯的拆分效果。首先将野生型酯酶est13编码基因(seqid no.2)与表达载体pet28a(+)连接，构建重组表达质粒。然后将重组表达质粒转化到e.coli bl21(de3)中。以含有酯酶基因的重组表达质粒为模板，通过定点突变技术进行基因改造，然后将重组表达质粒转化到e.coli bl21(de3)中得到含有酯酶突变体基因的e.coli bl21(de3)基因工程菌。对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组酯酶突变体的菌体细胞，培养液与菌体分离得到酯酶突变体粗酶液。将突变体酯酶与野生酯酶的立体选择性进行比较，筛选得到拆分性能优异的突变体。

8、本发明涉及所述重组酯酶突变体在催化3-环己烯-1-甲酸甲酯制备(s)-3-环己烯-1-甲酸中的应用，具体所述应用为：以含重组酯酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的粗酶液或纯化后的纯酶液为催化剂，以3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，以ph值为6-9(优选7)的磷酸钠缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20-40℃(优选20℃)，600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得(s)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，然后在碱性条件下加热水解得到(s)-3-环己烯-1-甲酸。所述催化剂用量以湿菌体重量计为20-200g/l(优选20g/l)，以粗酶液或纯酶液中蛋白浓度计为10-30mg/l(优选20mg/l)；所述底物的初始浓度为10-700g/l(优选100g/l)。

9、所述(s)-3-环己烯-1-甲酸甲酯在碱性条件下加热水解得到(s)-3-环己烯-1-甲酸方法为：将(s)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入1.0m naoh水溶液50℃加热回流搅拌反应6h，再加入1.0m hcl水溶液调节ph至5.0，加入等体积二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用无水na2so4干燥，过滤，旋转蒸发得到(s)-3-环己烯-1-甲酸。

10、优选的，所述缓冲液为100mm、ph7.0的磷酸钠缓冲溶液。

11、本发明所述含重组酯酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含有重组酯酶突变体编码基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基，37℃，180rpm下培养10h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体od600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。

12、本发明所述粗酶液的制备方法为：将所述湿菌体加入100mm、ph7.0的磷酸钠缓冲溶液重悬，冰浴条件下进行超声破碎(200w功率，持续1s，间歇2s，连续破碎15min)，获得细胞破碎液；将超声破碎后获得的细胞破碎液于8000rpm、4℃离心10min，所得到的上清即为粗酶液；所述湿菌体按每0.2g加入9.8ml磷酸钠缓冲溶液重悬。

13、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

14、本发明提供了一系列对外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯具有高催化活力、高立体选择性的酯酶突变体，具有反应条件温和、底物浓度高、立体选择性高、反应时间短、催化剂处理步骤简单、对坏境友好的优点，比如30℃条件下，20g/l的酯酶突变体(粗酶液)能够在2h内催化70g/l的外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯，转化率>38％，e.e.s>99％，在90分钟内完全催化100g/l 3-环己烯-1-甲酸甲酯，明显优于现有报道的脂肪酶。